• facebook
  • njikọ
  • youtube

Ihe mmalite: RNA

Ntugharị ọnụọgụ ọnụọgụ PCR (RT-qPCR) bụ usoro nnwale ejiri na nnwale PCR na-eji RNA dịka ihe mmalite.Na usoro a, a na-ebu ụzọ degharịa RNA ma ọ bụ onye ozi RNA (mRNA) ka ọ bụrụ DNA nkwado (cDNA) site na ntụgharị transcriptase.Mgbe nke ahụ gasịrị, emere mmeghachi omume qPCR site na iji cDNA dị ka ndebiri.Ejiri RT-qPCR mee ihe n'ọtụtụ ngwa usoro ihe ọmụmụ ihe, gụnyere nyocha okwu mkpụrụ ndụ ihe nketa, nnabata RNA, nkwado microarray, nchọpụta pathogen, nnwale mkpụrụ ndụ ihe nketa, na nyocha ọrịa.

Otu nzọụkwụ na ụzọ abụọ maka RT-qPCR

Enwere ike imezu RT-qPCR site na otu nzọụkwụ ma ọ bụ ụzọ abụọ.Otu nzọụkwụ RT-qPCR na-ejikọta ntụgharị ntụgharị na mmụba PCR, na-enye ohere ntụgharị transcriptase na DNA polymerase mezue mmeghachi omume n'otu tube n'okpuru otu ọnọdụ nchekwa.Otu nzọụkwụ RT-qPCR na-achọ naanị iji ngwa ngwa akọwapụtara n'usoro.Na RT-qPCR nzọụkwụ abụọ, a na-eme ntụgharị ntụgharị na PCR n'ime akpa abụọ, na-eji ihe nchekwa dị iche iche emebere, ọnọdụ mmeghachi omume, na atụmatụ nhazi nke mbụ.

isiokwu1

 

Uru

Mwepu

Otu Nzọụkwụ Usoro a nwere obere njehie nnwale ka a na-eme mmeghachi omume abụọ n'otu tube

 

Nzọụkwụ ọkpọkọ ole na ole na-ebelata ohere nke mmetọ

 

Kwesịrị ekwesị maka nkwalite / nyocha dị elu, ngwa ngwa na mmeghari

Enweghị ike imezi mmeghachi omume nzọụkwụ abụọ iche iche

 

Ebe ọ bụ na ọnọdụ mmeghachi omume na-emebi site na ijikọta mmeghachi omume nke abụọ, mmetụta uche adịghị mma dịka nke usoro nzọụkwụ abụọ.

 

Ọnụọgụ ebumnuche nke otu nlele achọpụtara dị ntakịrị

Nzọụkwụ abụọ Ikike imepụta ọba akwụkwọ cDNA kwụsiri ike nke enwere ike ịchekwa ogologo oge ma jiri ya mee ọtụtụ mmeghachi omume

 

Enwere ike ịbawanye mkpụrụ ndụ ihe nketa na mkpụrụ ndụ ntụaka site n'otu ọba akwụkwọ cDNA na-enweghị mkpa maka ọtụtụ ọba akwụkwọ cDNA.

 

Ihe nchekwa mmeghachi omume na ọnọdụ mmeghachi omume na-eme ka njikarịcha nke otu mmeghachi omume na-agba ọsọ

 

Nhọrọ mgbanwe nke ọnọdụ mkpalite

Iji otutu tubes, yana usoro pipetting ndị ọzọ na-abawanye ohere nke mmetọ DNA,

na-ewe oge.

 

Na-achọ njikarịcha karịa usoro otu nzọụkwụ

Ngwaahịa ndị emetụtara:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Otu Nzọụkwụ) -SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Otu Nzọụkwụ) -Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix Maka Synthesis CDNA nke mbụ

Ezigbo oge PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Ezigbo oge PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Nhọrọ nke mkpokọta RNA na mRNA

Mgbe ị na-emepụta nnwale RT-qPCR, ọ dị mkpa ikpebi ma ị ga-eji RNA mkpokọta ma ọ bụ mRNA dị ọcha dị ka ndebiri maka ntụgharị ntụgharị.Ọ bụ ezie na mRNA nwere ike ịnye mmetụta dịtụ elu, a ka na-ejikarị RNA na-ejikarị eme ihe.Ihe kpatara nke a bụ na mkpokọta RNA nwere uru dị mkpa dị ka ihe mmalite karịa mRNA.Nke mbụ, usoro a chọrọ usoro nchacha dị ole na ole, nke na-eme ka mgbake dị mma nke ndebiri dị mma yana ịmegharị nsonaazụ ka mma ịmalite nọmba ekwentị.Nke abụọ, ọ na-ezere nzọụkwụ nkwalite mRNA, nke nwere ike izere ohere nke nsonaazụ skewed n'ihi mgbake dị iche iche nke mRNA dị iche iche.N'ozuzu, ebe ọ bụ na n'ọtụtụ ngwa, ọnụọgụ nke mkpụrụ ndụ ihe nketa dị mkpa karịa nghọta zuru oke nke nchọpụta ahụ, mkpokọta RNA dabara adaba n'ọtụtụ ọnọdụ.

Ntugharị ntụgharị ntụgharị

Na usoro nzọụkwụ abụọ, ụzọ atọ dị iche iche nwere ike iji mee ka mmeghachi omume cDNA pụta: oligo(dT) primers, random primers, ma ọ bụ usoro-kpọmkwem primers.Otutu, oligo(dT) primers na random primers na-eji nchikota.Ihe mbido ndị a na-agbanye na strand mRNA template ma na-enye ntụgharị transcriptase na mmalite maka njikọ.

edemede2

Nhọrọ izizi Nhazi na ọrụ Uru Mwepu
Oligo (dT) primer (ma ọ bụ oligo (dT) primer) Mgbatị agbatị na ihe fọdụrụ nke thymine na ọdụ poly(A) nke mRNA;arịlịka oligo(dT) nwere G, C, ma ọ bụ A na njedebe 3′ (saịtị arịlịka) Njikọ nke cDNA zuru oke sitere na poly(A) -tailed mRNA

 

Ọdabara mgbe ihe mmalite dị obere

 

Saịtị arịlịka na-achọpụta na primer oligo(dT) jikọtara na ọdụ 5′ poly(A) nke mRNA.

Naanị adabara mkpụrụ ndụ ihe nketa na ọdụ poly(A).

 

Nweta cDNA ewepụsịrị site na saịtị priming*2 na poly(A)

 

Ọpụrụiche iji kechie ruo n'isi 3′*

 

* A na-ebelata ohere a ma ọ bụrụ na ejiri primer oligo(dT) emechiri emechi

random primer

 

6 ruo 9 ntọala n'ogologo, nke nwere ike ịkagbu ọtụtụ saịtị n'oge ederede RNA Anneal na RNA niile (tRNA, rRNA, na mRNA)

 

Kwesịrị ekwesị maka ndegharị nwere ụkpụrụ nke abụọ pụtara ìhè, ma ọ bụ mgbe ihe mmalite dị obere

 

Mpụta cDNA dị elu

A na-atụgharị cDNA site na RNA niile, nke a na-anaghị achọkarị ma nwee ike mebie mgbama nke mRNA ebumnuche.

 

gbatịa cDNA

usoro-kpọmkwem primers Ndokwa omenala na-ezubere usoro mRNA akọwapụtara ọbá akwụkwọ cDNA akọwapụtara

 

Melite uche

 

Iji reverse qPCR primers

Naanị na njikọ nke otu mkpụrụ ndụ ihe nketa ebumnuche

tụgharịa transcriptase

Reverse transcriptase bụ enzyme nke na-eji RNA mee DNA.Ụfọdụ ntụgharị ntụgharị nwere ọrụ RNase ma nwee ike weda eriri RNA na eriri RNA-DNA ngwakọ ka edegharịchara ya.Ọ bụrụ na ọ nweghị ọrụ enzymatic RNase, enwere ike ịgbakwunye RNaseH maka ịrụ ọrụ qPCR dị elu.Enzymes ndị a na-ejikarị gụnyere Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase na avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Maka RT-qPCR, ọ dị mma ịhọrọ transcriptase na-agbanwe agbanwe na okpomọkụ dị elu, nke mere na enwere ike ịme njikọ cDNA na okpomọkụ dị elu, na-eme ka nsụgharị RNA na-aga nke ọma na nhazi nke abụọ dị elu, ebe ha na-ejigide ọrụ ha zuru oke n'oge mmeghachi omume ahụ, na-ebute mpụta cDNA dị elu.

Ngwaahịa ndị emetụtara:

M-MLV Reverse Transcriptase

Ọrụ RNase H nke ntụgharị transcriptase

RNaseH nwere ike iweda eriri RNA site na RNA-DNA duplexes, na-enye ohere njikọ nke ọma nke DNA nwere eriri abụọ.Agbanyeghị, mgbe ị na-eji ogologo mRNA dị ka ndebiri, RNA nwere ike weda ya ngwa ngwa, na-ebute cDNA agbajie.Ya mere, ọ na-abakarị uru ibelata ọrụ RNaseH n'oge cDNA cloning ma ọ bụrụ na achọrọ njikọ nke ogologo ederede.N'ụzọ dị iche, ntụgharị ntụgharị na ọrụ RNase H na-abakarị uru maka ngwa qPCR n'ihi na ha na-eme ka agbaze nke RNA-DNA duplexes n'oge okirikiri mbụ nke PCR.

Nhazi mbụ

PCR primers ejiri mee ihe maka nzọụkwụ qPCR na RT-qPCR kwesịrị ka emebere ya ka ọ gbasaa oghere exon-exon, ebe ihe nkwalite nwere ike gbasaa n'ezie oke exon-intron.Ebe ọ bụ na usoro DNA genomic nwere intron adịghị amụbawanye, imewe a na-ebelata ohere nke adịgboroja adịgboroja na-abawanye site na DNA genomic.

Ọ bụrụ na enweghị ike ịmebe primers iji kewapụ oke exons ma ọ bụ exon-exon, ọ nwere ike ịdị mkpa iji DNase I ma ọ bụ dsDNase na-enweghị RNase na-agwọ sample RNA iji wepụ mmetọ DNA nke genomic.

RT-qPCR njikwa

Ekwesịrị itinye njikwa na-adịghị mma ntụgharị ntụgharị (-RT) na nnwale RT-qPCR niile iji chọpụta mmetọ DNA (dị ka ngwaahịa DNA genomic ma ọ bụ ngwaahịa PCR sitere na mmeghachi omume gara aga).Njikwa a nwere ihe mmeghachi omume niile ma ewezuga transcriptase ntụgharị.Ebe ọ bụ na ntụgharịgharị azụ emeghị site na njikwa a, ọ bụrụ na ahụrụ nkwalite PCR, ọ ga-abụ na mmetọ sitere na DNA.


Oge nzipu: Ọgọst-02-2022