RT-qPCR bụ nnwale bụ isi nke bayoloji molekụla, onye ọ bụla ga-amarịrị ya.Ọ na-agụnye usoro atọ: mmịpụta RNA, ntụgharị ntụgharị n'ime cDNA, na ezigbo oge fluorescent quantitative PCR.Ọ naghị enyere aka, gịnị na-eme?O yikarịrị ka enwere nsogbunnwale ntụgharị ntụgharị!Agbanyeghị na ọ dị ka nnwale ntụgharị ntụgharị naanị kwesịrị ịgbakwunye RNA, dNTP, primers natụgharịa transcriptasena tube centrifuge ma gwakọta nke ọma, ma n'ime usoro ọrụ n'ezie, a ka nwere ọtụtụ nkọwa dị mkpa ka e lebara anya.Ka anyị mụọ banyere ya!

Kedu otu esi ekpe ikpe ogo RNA?
Iji nweta cDNA, ogo RNA dị oke egwu!Enwere ike ịchọpụta ogo RNA site na akụkụ abụọ:
(1) Iguzosi ike n'ezi ihe RNA:Enwere ike ịchọpụta iguzosi ike n'ezi ihe RNA site na agarose gel electrophoresis. Na-ewere eukaryotes dị ka ihe atụ, ngụkọta RNA zuru ezu nwere eriri atọ doro anya, nha molekụla site na nnukwu ruo obere bụ 28S, 18S, na 5S, na 28S na-egbuke egbuke okpukpu abụọ ka 18S;Ọ bụrụ na enwere ike ịhụ eriri atọ, mana ụdị band ahụ na-agbaji agbaji ma ọ bụ mgbasa pụtara na RNA na-emebi emebi.N'oge a, biko mee mmeghachi omume ntụgharị ntụgharị ozugbo wee welie ndenye ndebiri nke ọma;Ọ bụrụ na naanị otu band nwere obere ihe dị arọ ma ọ bụ na-enweghị eriri nwere ike ịhụ, RNA emebirila kpamkpam ma ọ dị mkpa ka ewepụtara ya ọzọ.Agilent 2100 na-egosi iguzosi ike n'ezi ihe nke RNA nwere eserese kacha elu yana uru RIN.Ọ bụrụ na acid nucleic adịghị emebi emebi, ntọala nke electropherogram dị larịị;ọ bụrụ na nucleic acid na-emebi emebi nke ukwuu, ntọala ntọala adịghị eguzobe na ọnụ ọgụgụ ndị ọzọ na-emebi emebi na-apụta;uru nke RIN na-egosipụta iguzosi ike n'ezi ihe nke RNA, n'ime oke nke 0-10, ka uru ya buru ibu, ka mma nke RNA dị mma.Ọfọn, elu ogo nke izu oke.
(2) Ịdị ọcha nke RNA:Enwere ike ịchọpụta oke nke OD260/280 site na UV spectrophotometry.Ọ bụrụ na nha nke OD260/280 dị n'etiti 1.9 na 2.1, ịdị ọcha dị ezigbo mma.
DNA nke fọdụrụnụ nwere ike ibute nsonaazụ ọnụọgụ na-ezighi ezi
Mgbe ewepụtara RNA, RNA anyị nwetara nwere ike ịgwakọta ya na DNA genomic (gDNA) nke a na-ehichabeghị.Ya mere, a ga-agwakọta cDNA mgbe ntụgharị ntụgharị ya na yagDNA.N'oge ọdịdaqPCRmmeghachi omume,cDNAna gDNA nwere ike ịbawanye n'otu oge, na-ebute uru CT dị ntakịrị, ya mere nsonaazụ ya nwere ike bụrụ nke na-adịghị mma.
Ya mere, gịnị ka anyị kwesịrị ime n'ọnọdụ a?Mbidona-atụ aro:
(1) Mee genome ihicha na RNA tụgharịa, nke nwere ike wepu ya site na mmịpụta kọlụm n'oge mmịpụta RNA;
(2) Jiri DNAse gwọọ RNA ewepụtaraI , ma kwụsị ya na EDTA;
nke reagent transcriptionna modul mkpochapụ genome;

Otu esi ahọrọ primers maka ntụgharị ntụgharị?
Ntụgharị ntụgharị ntụgharị na-emetụtakwa nsonaazụ ntụgharị ntụgharị.Ị nwere ike họrọ random primers, Oligo dT ma ọ bụ gene-kpọmkwem primers maka ntụgharị ntụgharị dịka ọnọdụ akọwapụtara nke nnwale ahụ siri dị:
(1) Ndekọ ederede akọwapụtara: A na-akwado primers kpọmkwem mkpụrụ ndụ ihe nketa;
(2) Ndekọ mpempe akwụkwọ ogologo: Oligo dT / gene-kpọmkwem primers na-atụ aro;
(3) Iberibe dị n'ime nke ederede ogologo akụkụ: gene-kpọmkwem primers/ random primers / random primers + Oligo dT.Ọ bụrụ na a na-eme nyocha qPCR na-esote, Oligo dT enweghị ike iji naanị ya, n'ihi na iji Oligo dT naanị nwere ike ime ka njedebe 3' njedebe , na-eduga na nsonaazụ nnwale qPCR na-ezighi ezi;
(4) miRNA: Enwere ike iji primers stem-loop ma ọ bụ tailing primers.

Ugboro ole ka ekwesịrị ịgbanye cDNA ngwaahịa ntụgharị maka ọnụọgụ?
Mgbe ị nwetasịrị cDNA nke ngwaahịa ntụgharị ntụgharị, ugboro ole cDNA kwesịrị ịgbanye maka nnwale qPCR dị ezigbo mkpa.Ọ bụrụ na ntinye cDNA dị oke elu ma ọ bụ dị ala, enwere ike imetụta arụmọrụ nkwalite.Enwere ike tụọ mkpokọta cDNA, oleekwa otú e kwesịrị isi mee ya?
(1) Enweghị ike ịlele ntinye cDNA nke ngwaahịa ntụgharị ntụgharị, n'ihi na na mgbakwunye na ngwaahịa cDNA, ngwaahịa ntụgharị ntụgharị ahụ nwekwara ihe rescription residual Buffer, reverse transcriptase, primers, wdg, nke ga-egbochi nsonaazụ nleba anya wee mee ka OD260/280, OD260/230 na-egosipụta ezi cDNA.N'oge a, ụfọdụ ndị enyi ga-asị, mgbe ahụ, m ga-atụle ịta mgbe emechara ọcha;ebe a, Foregene ga-achọ icheta na cDNA adịghị atụ aro ka ọ dị ọcha, n'ihi na ogologo cDNA nwetara site na ntụgharị dị iche, na cDNA dị mkpirikpi ga-efunahụ na ịdị ọcha.
(2) Ya mere, gịnị ka ị ga-eme?Tupu nnwale qPCR, enwere ike ikpebi gradient nke cDNA site na nnwale mbụ.Ọmụmaatụ: jiri cDNA ngwaahịa ngwọta, 10-fold dilution, na 100-fold dilution dị ka ndebiri maka qPCR nnwale, na họrọ dilution factor na CT uru na nso nke 18-28.

Kedu ka ekwesịrị isi degharịa miRNA?
miRNA bụ obere molekul RNA nwere otu eriri nwere nha nke ihe dịka 22 nt nke na-adịghị etinye maka protein.N'ihi ogologo ya dị mkpụmkpụ, usoro qPCR a na-emekarị na-esiri ike ịkọwapụta ya kpọmkwem, ya mere ọ na-adịkarị mkpa ịgbatị miRNA;Ụzọ ntụgharị ntụgharị a na-ejikarị maka miRNA gụnyere usoro stem-loop na usoro ọdụ ọdụ.
Usoro stem-loop bụ ịgbatị miRNA site n'ịgbakwunye primers stem-loop.Usoro nchọpụta a nwere mmetụta dị elu na nkọwapụta, mana ntinye nchọpụta dị ala.Otu ntụgharị ntụgharị nwere ike ịchọpụta naanị otu miRNA na ntụaka dị n'ime;usoro ntinye ọdụ ọdụ bụ nke abụọ mejupụtara ya site na njikọ njikọta nke enzymes abụọ, nke bụ PolyA polymerase na ntụgharị transcriptase.PolyA polymerase na-ahụ maka ịgbakwụnye PolyA ọdụ na miRNA iji mụbaa ogologo ya, na ntụgharị transcriptase na-eme mmeghachi omume ntụgharị ntụgharị.Usoro a nwere ntinye nchọta dị elu ma nwee ike ịchọpụta ọtụtụ miRNA na nrụtụ aka dị n'ime n'otu ntụgharị ntụgharị, mana nghọta na nkọwapụta dị ala na usoro stem-loop.