Onye ọ bụla na-ekwu maka ụkpụrụ nke nnwale qRT-PCR, nhazi mbụ, nkọwa nsonaazụ, wdg, mana echere m na m ga-eso gị kerịta ọrụ nnwale nke qRT-PCR.Ọ dị obere, mana ọ gbasara nsonaazụ.

Tupu anyị eme qRT-PCR, anyị kwesịrị inwe nghọta doro anya banyere RNA nke anyị na ụzọ ọrụ anyị.A sị ka e kwuwe, mbọ anyị na-agba bụ ka anyị rụpụta ihe, ọ bụghị naanị ime ya.Yabụ tupu ịme qRT-PCR, anyị kwesịrị ikpebi okwu ndị a (ụfọdụ n'ime ha na-emetụta naanị SYBR).

1 Ị ji n'aka na RNA gị adịghị ala ala?

NanoDrop 2000 nwere ike ịchọpụta naanị ntinye na ịdị ọcha nke RNA, mana enweghị ike ịchọpụta iguzosi ike n'ezi ihe nke RNA.

Uru RNA (Nọmba Intesity Number) nwere ike igosipụta iguzosi ike n'ezi ihe nke RNA, nke sistemu Agilent 2100 Bioanalyzer na-achọpụta.

Ihe osise eserese nke ụkpụrụ RIN maka ụdị RNA dị iche iche (eukaryotes)

Agbanyeghị, ụlọ nyocha n'ozuzu enweghị Agilent 2100 Bioanalyzer.N'okwu a, anyị nwere ike ịchọpụta site na formaldehyde gel, ma ihe achọrọ maka ngụkọta ego nke RNA dị elu, ya mere usoro kachasị ngwa ngwa bụ iji gel electrophoresis nkịtị.A na-achọrọ ka ọ nọrọ na ebe a na-enweghị nuclease, ya mere ọ dị mkpa iji kpochaa tank electrophoresis, karama sol, gel bracket na comb na mmiri DEPC.Agarose enweghịkwa nuclease (ọ bụrụhaala na emepere ya ọhụrụ), na Loading Buffer kwesịrị imeghe nke ọma dị ka o kwere mee, yana gel 1.2%.

Rịba ama na gel ga-agbaze kpamkpam, ma ọ bụghị ya, ọ ga-eme ka eriri ndị na-adịghị mma, dị ka egosiri na nlele 9 na ọnụ ọgụgụ ahụ.Ọ bụrụ na voltaji ahụ dị oke elu ma ọ bụ na-agba ọsọ ogologo oge ga-emepụta okpomọkụ ma mee ka RNA ghara ịdị, ya mere, voltaji na oge kwesịrị ịchịkwa nke ọma.Tụkwasị na nke ahụ, ịgba ọsọ gel nwekwara ike ikpebi ma ọ dị ihe fọdụrụ DNA na ihe nlele ahụ, ma hụ ma enwere ọnụ ọgụgụ buru ibu nke eriri echekwabara na nkesa nke ọma.

Onyonyo.Gel electrophoresis nchọpụta nke RNA

2 Ị ji n'aka na mgbata cDNA gị dị?

Ahụmahụ nke ụmụnna ukwu na ụlọ nyocha bụ na cDNA nke usoro 20 ul nwetara site na ntụgharị ọ bụla na-agbaze ozugbo 20X, ebe ụmụnna nwanyị post-doctoral na-agbaze 10X.M na-adaberekarị n'ọnọdụ ahụ.N'ihi na àgwà RNA nke onye ọ bụla kwuru na ya dị iche, ọkwa nke ngbanwe dịkwa iche, na nkà na ụzụ ntụgharị nwere ike ọ gaghị adị mma.

Ya mere, oge ọ bụla m nwetara cDNA ntụgharị, m ga-ebu ụzọ mee ya ihe dị ka ugboro 3, wee jiri usoro nlekọta ụlọ mee RT-PCR, ọnụ ọgụgụ nke cycles na-abụkarị 25 cycles, iji chọpụta ntinye uche kpọmkwem, wee chọpụta ihe ikpeazụ dilution ihe.

3 Ị ji n'aka na primers gị dị mfe iji?

Ọ nwere ike ịgafe usoro mgbaze nke qRT-PCR, mana nke a ka na-efu ego.Maka ụlọ nyocha na-enweghị nnukwu ego, mgbe ha nwetara ọtụtụ primers, ha nwere ike iji RT-PCR nkịtị hụ ma ọ bụ otu ìgwè ma chọpụta kpọmkwem ihe ndị na-emepụta ihe.Ọ bụrụ na ụlọ nyocha ahụ adịghị ụkọ ego, a pụrụ ịmata kpọmkwem ihe niile primers otu ugboro site na agbaze agbaze.

4 Ị ji n'aka na ọnọdụ nnwale gị dabara adaba?

Ekwesịrị ichebe SYBR site na ọkụ siri ike, yabụ gbalịa gbanyụọ ọkụ dị n'elu mgbe ị na-agbakwunye reagent SYBR, naanị ịkwesịrị iji ìhè na-enweghị isi iji wuchaa ya.

Chekwa SYBR na 4°C.Mgbe a na-eji ya eme ihe, jiri nwayọọ tụgharịa elu na ala ka ọ gwakọta nke ọma ka ị ghara ịfụ ụfụfụ, ma emela vortex ike.

Ụfọdụ ụmụnna nwanyị na-eto eto na-enwe mmasị ise akara na bọọdụ PCR n'ihi egwu ịgwakọta ihe nlele ahụ, nke dị njọ.N'ihi na akara gị nwere ike imetụta mkpokọta mgbama fluorescent, ana m akwadokarị ndị obere ka ha jiri akwụkwọ ndetu nnwale iji nyere aka na ebe nchekwa, dị ka egosiri n'okpuru.

Onyonyo.qRT-PCR ihe atụ nbudata eserese

5 Ị ji n'aka na ị na-eme ya nke ọma?

Jide n'aka na ị na-eyi uwe aka, yi uwe aka, yi uwe aka, na-ekwu ihe ndị dị mkpa ugboro atọ.

Iji belata mkpughe nke SYBR na ọkụ, ọ masịrị m n'onwe m ibu ụzọ tinye template, dị ka egosiri na foto dị n'okpuru.Dị ka ahụmahụ si kwuo, mgbakwunye nke obere template nwere ike ịkpata njehie nlele.Ya mere, iji belata njehie kpatara site n'ịgbakwụnye obere template, m na-ejikarị okpukpu abụọ mee ihe ọzọ, ma jiri okpukpu abụọ mee ihe mgbe ị na-agbakwụnye ihe nlele ahụ iji belata ego H2O2 agbakwunyere.

Onyonyo.Eserese atụmatụ nke ntinye qRT-PCR

Mgbe ahụ hazie usoro qRT-PCR dị ka ndị a.

Onyonyo.qRT-PCR eserese eserese

IHE: A ghaghị ime usoro nhazi ahụ na ice.

Mgbe ịgbakwunye sample, mado transperent akara ihe nkiri.Gbalịa ka ị ghara iji aka gị emetụ elu nke ihe nkiri mkpuchi transperent, rụọ ọrụ site na oghere dị n'akụkụ abụọ nke ihe nkiri ahụ.N'ihi na akara mkpịsị aka nwekwara ike imetụta mkpokọta mgbama fluorescent.Mgbe ahụ, jiri centrifuge mee ngwa ngwa centrifuge maka 10 s na obere ọsọ iji gbochie ihe nlele ahụ ka ọ kwụgidere na mgbidi.

Ngwaahịa ndị emetụtara:

Ngwa Cell Direct RT-qPCR

RT Mfe II