Uru Ct bụ ụdị ngosipụta kacha mkpa nke PCR nke fluorescent quantitative.A na-eji ya gbakọọ ọdịiche okwu mkpụrụ ndụ ihe nketa ma ọ bụ ọnụọgụ mkpụrụ ndụ ihe nketa.Yabụ kedu uru Ct nke fluorescence quantification weere na ezi uche dị?Kedu ka ị ga-esi hụ na ọnụọgụ Ct dị irè?
Kedu ihe bụ Ct Value?
N'oge usoro nkwalite qPCR, ọnụ ọgụgụ nke nha nha nha nha (Cycle Threshold) mgbe mgbama fluorescence nke ngwaahịa a na-amụbawanye rutere n'ọnụ ụzọ ncha ọkụ.C na-anọchi anya Cycle na T na-anọchi anya ọnụ ụzọ.N'ikwu ya n'ụzọ dị mfe, uru Ct bụ ọnụ ọgụgụ nke cycles kwekọrọ na mgbe nkwalite ndebiri mbụ ruru ụfọdụ ngwaahịa na qPCR.A ga-akọwa ihe a na-akpọ "otu ego ngwaahịa" ma emechaa.
Kedu ihe uru Ct na-eme?
1.Relationship n'etiti exponential amplification, template ego na Ct uru
Dị ka o kwesịrị, a na-akwakọba mkpụrụ ndụ ihe nketa na qPCR site na nkwuwa okwu mgbe ọnụọgụ ụfọdụ nke okirikiri gachara.Mmekọrịta dị n'etiti ọnụọgụ nke okirikiri mmụba na ọnụọgụ ngwaahịa bụ: Ọnụ ego ngwaahịa agbakwunyere = ọnụọgụ ndebiri mbụ × (1+En) nọmba okirikiri.Agbanyeghị, mmeghachi omume qPCR abụghị mgbe niile n'ọnọdụ dị mma.Mgbe ọnụọgụ ngwaahịa agbagoro ruru “ụfọdụ ego ngwaahịa”, ọnụọgụ cycles n'oge a bụ uru Ct, ọ dịkwa n'oge nkwuwa okwu.Mmekọrịta dị n'etiti uru Ct na ọnụọgụ mmalite mmalite: Enwere mmekọrịta dị n'etiti uru Ct nke template na logarithm nke nọmba mmalite nke ndebiri.Ihe dị elu nke ntinye template mbụ, nke dị ntakịrị uru Ct;na ala nke mbụ template ntinye uche, ibu Ct uru.
2.Amplification curve, fluorescence threshold na ụfọdụ PCR ngwaahịa ego
A na-egosi ọnụọgụ ngwaahịa qPCR ozugbo n'ụdị mgbama fluorescent, ya bụ, usoro mmụba.N'oge mmalite nke PCR, mmụba ahụ dị n'okpuru ọnọdụ dị mma, ọnụ ọgụgụ nke cycles dị ntakịrị, nchịkọta ngwaahịa dị ntakịrị, na ọkwa nke fluorescence enweghị ike ịmata nke ọma na ndabere nke fluorescence.Mgbe nke ahụ gasịrị, fluorescence na-abawanye ma na-abanye n'usoro ihe ngosi.Enwere ike ịchọpụta ọnụọgụ PCR n'otu oge mgbe mmeghachi omume PCR dị naanị n'usoro nkwuputa, nke enwere ike iji dị ka "ụfọdụ ngwaahịa", enwere ike wepụta ọdịnaya mbụ nke ndebiri na nke a.Ya mere, ike mgbaama fluorescence kwekọrọ na ngwaahịa ụfọdụ bụ ọnụ ụzọ ọkụ.
N'ọgwụgwụ PCR, usoro nkwuwapụta anaghịzi egosi nkwuwa okwu, wee banye n'usoro ahịrị na nkeji ala dị larịị.
3.Reproducibility nke ụkpụrụ Ct
Mgbe okirikiri PCR ruru ọnụọgụ okirikiri nke uru Ct, ọ ka abanyela n'ezi oge mmụba.N'oge a, obere mperi adịghị amụbawanye, ya mere mmeghari nke uru Ct dị mma, ya bụ, otu template ahụ na-abawanye n'oge dị iche iche ma ọ bụ na tubes dị iche iche n'otu oge.Amplification, uru Ct nwetara na-adịgide adịgide.
1.Amplification arụmọrụ En
Ịrụ ọrụ nkwalite PCR na-ezo aka na arụmọrụ nke polymerase na-atụgharị mkpụrụ ndụ ihe nketa ka ọ bụrụ amplicon.Ịrụ ọrụ nkwuwa okwu mgbe otu DNA molecule gbanwere ka ọ bụrụ mkpụrụ ndụ DNA abụọ bụ 100%.A na-egosipụtakarị arụmọrụ nkwalite dị ka En.Iji mee ka nyocha nke isiokwu ndị na-esote dị mfe, a na-ewebata ihe ndị na-emetụta arụmọrụ mmụba nkenke.
| Ihe na-emetụta | nkọwa | Kedu ka esi ekpe ikpe? |
| A. PCR inhibitors | 1. DNA template nwere ihe na-egbochi mmeghachi omume PCR, dị ka protein ma ọ bụ ihe ncha.2. cDNA mgbe ntụgharị ntụgharị nwere nnukwu ntinye nke template RNA ma ọ bụ RT reagent components, nke nwekwara ike igbochi mmeghachi omume PCR na-esote. | 1. Ma enwere mmetọ nwere ike ikpe ikpe site na ịlele nha nke A260/A280 na A260/A230 ma ọ bụ RNA electrophoresis.2. Ma a na-agbaze cDNA dị ka akụkụ ụfọdụ si dị ka ntụgharị ntụgharị. |
| B. Nhazi primer na-ezighi ezi | Ihe nrịbama anaghị ekpochapụ nke ọma | Lelee primers maka primer-dimers ma ọ bụ ntutu isi, adabaghị, na mgbe ụfọdụ na-agbasa atụmatụ intronic. |
| C. Mmepụta mmemme mmeghachi omume PCR na-ezighi ezi | 1. primers enweghị ike ịkachapụ nke ọma2. Ntọhapụ ezughi oke nke DNA polymerase 3. Ogologo oge elu okpomọkụ DNA polymerase ọrụ belatara | 1. Igwe ọkụ na-ekpo ọkụ dị elu karịa uru TM nke primer2. Oge tupu denaturation dị mkpụmkpụ 3. Oge nke usoro ọ bụla nke usoro mmeghachi omume dị ogologo |
| D. ezughị ezu ịgwakọta reagent ma ọ bụ pipetting njehie | N'ime usoro mmeghachi omume, ntinye uche nke mpaghara mmeghachi omume PCR dị oke elu ma ọ bụ enweghị isi, na-ebute mmụba na-enweghị nkọwa nke PCR amplification. | |
| E. Amplicon Ogologo | Ogologo amplicon dị ogologo, gafere 300bp, yana arụmọrụ nkwalite ahụ dị ala. | Lelee na ogologo amplicon dị n'etiti 80-300bp |
| F. Mmetụta nke qPCR reagents | Ntinye uche nke DNA polymerase na reagent dị ala ma ọ bụ na emeghị ka ntinye nke ion na ihe nchekwa ahụ adịghị mma, na-eme ka ọrụ enzyme Taq ghara iru kacha elu. | Mkpebi nke nrụpụta nkwalite site na usoro ọkọlọtọ |
2.Range nke Ct ụkpụrụ
Ụkpụrụ Ct sitere na 15-35.Ọ bụrụ na uru Ct dị ihe na-erughị 15, a na-ahụta na mmụba ahụ dị n'ime oke nke oge mmalite ma eruteghị ọnụ ụzọ fluorescence.Dị ka o kwesịrị, enwere mmekọrịta dị n'etiti uru Ct na logarithm nke nọmba mbụ nke ndebiri, ya bụ, usoro ọkọlọtọ.Site na usoro ọkọlọtọ, mgbe arụmọrụ mmụba dị 100%, uru Ct gbakọrọ maka ịkọwapụta otu nọmba nke mkpụrụ ndụ ihe nketa dị gburugburu 35. Ọ bụrụ na ọ karịrị 35, ọnụọgụ mbụ nke ndebiri bụ ihe na-erughị 1, nke a pụrụ iwere na ọ bụ ihe na-abaghị uru.
Maka usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa Ct dị iche iche, n'ihi ọdịiche dị na ọnụọgụ mkpụrụ ndụ mkpụrụ ndụ ihe nketa na arụmọrụ nkwuputa na ọnụọgụ ndebiri mbụ, ọ dị mkpa ịme usoro ọkọlọtọ maka mkpụrụ ndụ ihe nketa wee gbakọọ ọnụọgụ ọnụọgụ nke mkpụrụ ndụ ihe nketa.
3.Ime mmetụta nke uru Ct
Site na mmekọrịta dị n'etiti ọnụ ọgụgụ nke mmụba cycles na ọnụ ọgụgụ nke ngwaahịa: ọnụ ọgụgụ nke ngwaahịa amplified = ọnụ ọgụgụ nke mbụ template × (1 + En) okirikiri nọmba, a pụrụ ịhụ na n'okpuru ezigbo ọnọdụ, ego nke mbụ template na En ga-enwe mmetụta ọjọọ na Ct uru.Ọdịiche dị na ogo ndebiri ma ọ bụ arụmọrụ nkwalite ga-eme ka uru Ct buru oke ibu ma ọ bụ obere.
4.Ct uru dị oke ma ọ bụ obere
Oge nzipu: Feb-22-2023
