Nkọwapụta nke nchọpụta
N'ọtụtụ ọnọdụ, ebumnuche nke nhazi primer bụ iji bulie nkọwapụta nke PCR.A na-ekpebi nke a site na mmetụta dị ukwuu ma ọ bụ obere amụma nke ọtụtụ mgbanwe.Otu mgbanwe dị mkpa bụ usoro dị na njedebe 3 nke primer.
N'ụzọ dị mkpa, nyocha PCR emebere maka nkọwapụta ga-enwe ike ịnọgide na-arụ ọrụ dị elu karịa oke ike dị iche iche, n'ihi na nyocha ahụ anaghị emepụta ngwaahịa nkwalite na-abụghị nke akọwapụtara, si otú a na-asọmpi PCR reagents ma ọ bụ na-egbochi mmeghachi omume nkwalite.
N'ezie, n'ọnọdụ ụfọdụ, nkọwapụta abụghị ihe kachasị mkpa, dịka ọmụmaatụ, mgbe ihe mgbaru ọsọ bụ ịkọwapụta njikọ chiri anya mana ọrịa dị iche iche, nhazi pụrụ iche, njikarịcha na ụkpụrụ nkwenye chọrọ.
Usoro mgbaze bụ usoro ọkọlọtọ maka ịlele nkọwapụta nke amplicon, opekata mpe n'ihe gbasara ma ọ ga-abawanye otu ebumnuche.Otú ọ dị, a ghaghị imesi ya ike na mgbaze na-agbaze nwere ike iduhie n'ihi na, dịka ọmụmaatụ, ha nwere ike imetụta mmetụta jikọtara ọnụ nke suboptimal primers na obere mkpokọta template.
P5 |Usoro mgbaze na-egosi mgbanwe Tm nke enwetara site na nchọpụta abụọ nke ọnụọgụ dị iche iche nke DNA abụọ lekwasịrị anya.
A. N'ọkwa dị elu (ad)), ọ nweghị ihe doro anya primer dimer ka emechara nha qPCR.Ka mkpokọta ndebiri na-ebelata ka ọ bụrụ 50 (e), ngwaahịa anaghị akọwapụta na-amalite ịpụta wee bụrụ naanị ngwaahịa na ntinye kacha ala (f).
B. Nnwale ahụ dekọtara otu Tms ahụ na mkpokọta ebumnuche niile, ma ọ nweghị ihe ọ bụla doro anya dimer na-ahụ anya ọbụlagodi na ntinye kacha nta (mbibi 5).Mgbe ị na-eji ụzọ nchọpụta abụọ a, ọ nweghị ngwaahịa nkwalite ahụrụ na NTC.
P5 na-egosi akụkụ mgbasa nke enwetara na nlele nke ndebiri dị na mkpokọta dị iche iche.P 5a na-egosi na na ọnụọgụ abụọ kachasị dị ala, Tms nke ngwaahịa nkwalite na-abụghị nke a na-emepụta dị ala karịa nke amplicon ndị a kapịrị ọnụ.
N'ụzọ doro anya, usoro nchọpụta a enweghị ike iji ntụkwasị obi mee ihe iji chọpụta ebumnuche ndị dị na obere mkpokọta.
N'ụzọ na-akpali mmasị, NTC, ya bụ, ihe nlele na-enweghị DNA ma ọlị, edekọghị ngwaahịa nkwalite (na-abụghị nke akọwapụtara), na-egosi na DNA genomic ndabere nwere ike isonye na nkwalite/polymerization na-abụghị nke akọwapụtara.
Mgbe ụfọdụ, ndị dị otú ahụ ndabere primers na ndị na-abụghị kpọmkwem njupụta enweghị ike imezi, ma ọ na-enwekarị ike chepụta a ụzọ nchọpụta nke na-enweghị na-abụghị kpọmkwem nkwalite na ihe ọ bụla template ntinye uche na NTC (P 5b).
N'ebe a, ọbụlagodi iji Cq nke 35 na-edekọ mmụba nke ebumnuche ebumnuche ga-ewepụta usoro mgbasa ozi akọwapụtara.N'otu aka ahụ, NTC egosighi ihe ịrịba ama nke nkwalite na-abụghị nke akọwapụtara.Mgbe ụfọdụ, omume nchọpụta ahụ nwere ike ịdabere na mmanya nne, yana naanị mmụba na-enweghị isi ka a na-achọpụta na ụfọdụ ihe nchekwa nchekwa, nke nwere ike jikọta na ntinye Mg2+ dị iche iche.
Nkwụsi ike nke nchọpụta
Nkwalite nke Ta bụ nzọụkwụ bara uru na nkwenye siri ike na usoro njikarịcha nke nchọpụta qPCR.Ọ na-enye ihe ngosi kpọmkwem nke siri ike nke primer setịpụrụ site n'igosi okpomọkụ (ma ọ bụ ọnọdụ okpomọkụ) nke na-emepụta Cq kasị ala n'ebughị ibu NTC.
Ọdịiche nke okpukpu abụọ ruo anọ nwere ike ọ gaghị adị mkpa maka ndị nwere okwu mRNA dị elu, mana maka nyocha nyocha, ọ nwere ike ịpụta ọdịiche dị n'etiti nsonaazụ adịghị mma na ụgha.
Njirimara Ta nke qPCR primers nwere ike ịdịgasị iche nke ukwuu.Ụfọdụ ule adịghị ike nke ukwuu, ma ọ bụrụ na emeghị ha n'okpuru uru Ta kachasị mma nke primers, ha ga-ada ngwa ngwa.
Nke a dị mkpa n'ihi na ụdị nchọpụta a na-enwekarị nsogbu na ụwa n'ezie, na ịdị ọcha nke ihe nlele ahụ, ntinye DNA, ma ọ bụ ọnụnọ nke DNA ọzọ nwere ike ọ gaghị adị mma.
Na mgbakwunye, nọmba nnomi nke ebumnuche nwere ike ịdịgasị iche n'ọtụtụ dị iche iche, na reagents, arịa plastik, ma ọ bụ ngwa nwere ike ịdị iche na nke eji eme ihe mgbe ị na-edozi ule.
P6|Mmụba okpomọkụ na-egosi ike dị iche iche nke nchọpụta PCR.
A. Jiri Bioline's Sensifast SYBR mastermix (nọmba katalọgụ BIO-98050) rụọ PCR na cDNA kwadebere site na ụbụrụ mmadụ RNA.
B. Jiri Bio-Rad's CFX qPCR ngwa ka ịdekọ maapụ mmụba yana usoro mgbasa nke apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGTGATCTCCTAGG).
C. Eserese mmụba na usoro mgbaze nke ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACCTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGCTCTGACTCAG).
D. Eserese mmụba na usoro mgbasa nke GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGATCTTC).
E. Cqs e dekọrọ na ọnọdụ okpomọkụ dị iche iche, na-egosi ọdịiche dị na Cq nke edere n'okpuru gradient okpomọkụ 7C.
P 6 na-egosi nsonaazụ nke ule na-adịghị mma, ebe qPCR mere site na iji gradient Tas n'etiti 59C na 67C (P 6a), na-eji primers maka mkpụrụ ndụ ihe nketa ụbụrụ mmadụ atọ.
Enwere ike ịhụ site na eserese mmụba na Opalin primers adịchaghị mma n'ihi na oke Ta kachasị mma ha dị warara (Njirimara 6b), ya bụ, Cqs na-agbasasị ebe niile, na-eme ka Cqs bụrụ nke ukwuu ma e jiri ya tụnyere Cqs Low kacha mma.
Usoro nchọpụta a anaghị akwụsi ike ma nwee ike ibute mmụba dị elu.Ya mere, ekwesịrị imegharị ụzọ abụọ a.Tụkwasị na nke ahụ, nyocha nke ịgbaze agbaze (ntinye) na-egosi na nkọwapụta nke usoro nchọpụta a nwekwara ike bụrụ nsogbu, n'ihi na agbaze agbaze nke Ta ọ bụla dị iche.
Ụzọ nchọpụta ACSBG1 nke egosiri na P 6c siri ike karịa usoro nchọpụta Opalin dị n'elu, ma ọ ka dị anya site na mma, ma eleghị anya ọ ga-eme ka ọ dịkwuo mma.
Otú ọ dị, anyị na-ekwusi ike na ọ dịghị njikọ dị mkpa n'etiti siri ike na nkọwapụta, n'ihi na nkwụsị nke mgbasa nke usoro nchọpụta a na-egosi otu uru kachasị elu na Tas niile (inset).
N'aka nke ọzọ, ule siri ike na-enwekarị ndidi, na-emepụta Cqs yiri ya n'ọtụtụ dịgasị iche iche nke Tas, dịka na ule GFAP nke egosiri na P 6d.
Ọdịiche dị na Cqs enwetara n'otu ogo Celsius 8 bụ ihe na-erughị 1, na mgbaze mgbasa (ntinye) na-akwado njirimara nchọpụta na oke okpomọkụ a.Ọ dị mma ịmara na Tas gbakọọ na oke Ta nwere ike ịdị iche.
Enwere ọtụtụ ụkpụrụ nduzi iji nyere ndị na-eme nchọpụta aka ịmepụta ndị na-emepụta ihe na-arụ ọrụ nke ọma, ọtụtụ n'ime ha na-adabere na iwu ogologo oge ma na-eleba anya na 3'njedebe nke primers.A na-atụkarị aro ka ịtinye G ma ọ bụ C na njedebe 3' yana G ma ọ bụ C abụọ (njigide GC), mana ọ bụghị ihe karịrị abụọ n'ime ntọala 5 ikpeazụ.
Na omume, iwu ndị a nwere ike iduzi ndị nyocha, mana ọ bụchaghị na ha ezighi ezi n'ọnọdụ niile.
P7 |Ngwunye 3′ nke primer nwere obere mmetụta na nkọwapụta ma ọ bụ arụmọrụ.
A. Ọnọdụ nke primers maka mmadụ HIF-1a (NM_181054.2) gene.
B. Jiri Agilent Brilliant III SYBR Green nne mmanya (Cat. No. 600882) mee ka ihe nyocha isii gbasaa.
C. Eserese mmụba na mgbaze agbaze nke ngwa Bio-Rad's CFX qPCR dekọrọ na 3′end primers.Egosiri NTC na uhie.
D. Cqs ndekọ nke ọ bụla ule ihe
Dịka ọmụmaatụ, nsonaazụ na P 7 megidere iwu 3′end.Nhazi niile na-arụpụta otu nsonaazụ ahụ, yana naanị njikọta primer abụọ na-eduga na mmụba na-abụghị nke akọwapụtara na NTC.
Otú ọ dị, anyị enweghị ike ịkwado mmetụta nke clip GC, n'ihi na na nke a, iji A ma ọ bụ T dị ka ihe kachasị elu nke 30 bases adịghị ebelata nkọwa.
Nnwale C, ebe F primer kwụsịrị na GGCC, dekọọ Cqs na NTC, na-egosi na mmadụ nwere ike ịzere usoro ndị a na njedebe 30.Anyị na-ekwusi ike na naanị otu ụzọ isi chọpụta usoro 3′nd kacha mma nke ụzọ abụọ bụ iji nyochaa ụfọdụ primers nnwale.
Nkwalite arụmọrụ
N'ụzọ dị mkpa, ọ bụ ezie na nchọpụta PCR na-abụghị nke a kapịrị ọnụ enweghị ike ịpụta kpọmkwem, enwere ike imeziwanye arụmọrụ na-abawanye n'ọtụtụ ụzọ dị iche iche site n'ịgbanwe enzyme, mmanya nne, ihe mgbakwunye, na ọnọdụ ịgba ígwè.
Iji nyochaa arụmọrụ nke nchọpụta PCR, ọ kacha mma iji usoro dilution nke 10 ma ọ bụ 5 ugboro nke nucleic acid lekwasịrị anya, ya bụ, "usoro ntụgharị ọkọlọtọ".
Ọ bụrụ na ejiri PCR amplicon ma ọ bụ ebumnuche DNA sịntetik na-emepụta usoro ọkọlọtọ, a ga-agwakọta dilutions nke ebumnuche ndị a na DNA ndabere mgbe niile (dị ka DNA genomic).
P8 |Usoro dilution iji nyochaa arụmọrụ nke PCR.
A. Jiri primers maka HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA na R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC na Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (nọmba katalọgụ 600882) maka PCR na ọnọdụ mgbaze.
B. 100 ng RNA ka edegharịrị azụ, gbazere ugboro 2, wee gbazee ihe nlele cDNA n'usoro ugboro ise ka ọ bụrụ 1 ng DNA genomic mmadụ.E gosipụtara mgbaze agbaze na ntinye.
C. A na-emegharị mmeghachi omume RT, dilution, na serial dilution maka nlele cDNA nke abụọ, nsonaazụ ya yiri.
P 8 na-egosi akụkụ abụọ nke ọkọlọtọ, na-eji otu ụzọ nchọpụta ahụ na ụdị cDNA abụọ dị iche iche, ihe ga-esi na ya pụta bụ otu arụmọrụ, ihe dị ka 100%, na uru R2 dịkwa otu, ya bụ, ogo nke dabara n'etiti data nnwale na akara nlọghachi azụ ma ọ bụ ogo data nke linearity.
Oghere ọkọlọtọ abụọ a na-atụnyere, mana ọ bụghị otu.Ọ bụrụ na ebumnobi a bụ ịkọwapụta ebumnuche nke ọma, a ga-amata na ọ bụ ihe a na-anabataghị ịnye ngụkọ ọnụọgụ nọmba na-akọwaghị ejighị n'aka.
P9 |Ejighi n'aka nledo jikọtara ya na ntule site n'iji usoro ọgbara ọhụrụ.
A. Jiri primers maka GAPDH (NM_002046) ịrụ PCR na ọnọdụ mgbaze.F: ACAGTTGCCATGTAGACC na R: TAACTGGTTGAGCACAGG na Bioline's Sensifast SYBR mastermix (nọmba katalọgụ BIO-98050).
B. Amplification chaatị, mgbaze agbaze na ọkọlọtọ usoro e dekọrọ na Bio-Rad's CFX qPCR ngwá.
C. Ihe eserese ọkọlọtọ na oge ntụkwasị obi 95% (CI).
D. Nọmba nnomi na oge ntụkwasị obi 95% nke ụkpụrụ Cq atọ ewepụtara site na usoro mgbaze.
P 9 na-egosi na maka ule kachasị mma, mgbanwe dị iche iche nke otu ọkọlọtọ ọkọlọtọ bụ ihe dị ka ugboro 2 (95% oge ntụkwasị obi, opekempe na kacha), nke nwere ike ịbụ obere mgbanwe nke enwere ike ịtụ anya.
Ngwaahịa emetụtara:
Ngwa anụ ahụ Animal Direct PCR
Oge nzipu: Sep-30-2021
