Nchịkọta
Nchọpụta ngwa ngwa nke osisi transgenic
Ederede/Tong Yucheng
Ọrụ nnwale/Han Ying
Editor/Wen Youjun
Okwu/1600+
Oge ọgụgụ akwadoro/nkeji 8-10
Nchọpụta ngwa ngwa nke osisi transgenic
Dị ka onye bịara ọhụrụ na ụlọ nyocha, ọ bụghị ezigbo ọrụ iji nyochaa osisi ndị dị mma site na ụyọkọ osisi nwere ọnụ ọgụgụ ntụgharị dị ala.Nke mbụ, a ga-ewepụta DNA n'ọtụtụ nlele n'otu n'otu, mgbe ahụ PCR ga-achọpụta mkpụrụ ndụ ihe nketa mba ọzọ.Agbanyeghị, nsonaazụ ya na-abụkarị oghere na eriri nwere ihe ole na ole mgbe ụfọdụ, mana ọ gaghị ekwe omume ikpebi ma enwere nchọpụta efu ma ọ bụ nchọpụta ụgha..Ọ bụ ihe na-enweghị enyemaka ihu usoro nnwale na nsonaazụ dị otú ahụ?Echegbula onwe gị, nwanne na-akuziri gị otu esi enyocha osisi transgenic n'ụzọ dị mfe na nke ọma.
Nzọụkwụ 1: Nchọpụta nchọpụta imewe
Kpebisie ike na mkpụrụ ndụ ihe nketa na exogenous nke a ga-achọpụta dịka ihe nlele a ga-anwale, wee họrọ onye nnọchite anya usoro 100-500bp n'ime mkpụrụ ndụ ihe nketa maka imepụta primer.Ezi primers nwere ike hụ na izi ezi nke nsonaazụ nchoputa ma belata oge nchọta (lee ihe mgbakwunye maka ngwa nchọpụta a na-ejikarị).
Mara:
Ihe mbụ emebere ọhụrụ kwesịrị ịkwalite ọnọdụ mmeghachi omume wee chọpụta izi ezi, nkenke, na oke nchọta nke nchọpụta tupu ha emee nchọpụta buru ibu.
Nzọụkwụ 2:Zụlite ụkpụrụ nnwale
Njikwa dị mma: Jiri DNA dị ọcha nke nwere iberibe ebumnuche dị ka ndebiri iji chọpụta ma sistemụ mmeghachi omume PCR na ọnọdụ ọ bụ ihe nkịtị.
Njikwa adịghị mma/oghe: Jiri ndebiri DNA ma ọ bụ ddH2Oh nke na-enweghị iberibe ebumnobi dị ka ndebiri iji chọpụta ma enwere isi iyi nke mmetọ na sistemụ PCR.
Njikwa ntụaka ime: jiri nchikota primer/nyocha nke mkpụrụ ndụ endogenous nke ihe nlele a ga-anwale iji nyochaa ma PCR nwere ike ịchọpụta template ahụ.
Mara:
Ekwesịrị ịtọ njikwa dị mma, adịghị mma / oghere na njikwa njikwa ime maka ule ọ bụla iji nyochaa izi ezi nke nsonaazụ nnwale.
Nzọụkwụ 3: Nkwadebe nnwale
Tupu ojiji, hụ ma ihe ngwọta ọ bụla agwakọtara.Ọ bụrụ na achọpụtara mmiri ozuzo, ọ dị mkpa ka agbaze ya ma gwakọta ya dịka ntuziaka tupu ejiri ya.Ngwakọta 2 × PCR kwesịrị ka a kpokọta ya ma gwakọta ya ugboro ugboro na micropipette tupu ejiri ya zere nkesa ion na-enweghị isi.
Mara:
Wepụ ntuziaka ma gụọ ha nke ọma, ma mee nkwadebe tupu nnwale ahụ n'ụzọ siri ike dabere na ntuziaka.
Kwụpụ 4: Kwadebe sistemu mmeghachi omume PCR
Dịka ụkpụrụ nnwale si dị, gwakọta primers, H2O, 2 × PCR mix, centrifuge ma kesaa ha na tube mmeghachi omume ọ bụla.
Mara:
Maka ule buru ibu ma ọ bụ ogologo oge, a na-atụ aro ka iji usoro mmeghachi omume PCR nwere UNG enzyme, nke nwere ike zere mmetọ ikuku aerosol nke ngwaahịa PCR kpatara.
Kwụpụ 5: Tinye ndebiri mmeghachi omume
N'iji teknụzụ PCR Direct, ọ dịghị mkpa maka usoro ịdị ọcha nucleic acid na-agwụ ike.Enwere ike ịkwado template sample n'ime nkeji iri ma tinye ya na usoro mmeghachi omume PCR kwekọrọ.
Mara:
Usoro Lysis nwere mmetụta nchọpụta ka mma, na ngwaahịa enwetara nwere ike iji mee ihe maka ọtụtụ mmeghachi omume nchọpụta.
5.1: PCR ozugbo nke akwụkwọ
Dị ka nha foto dị na ntuziaka ahụ si dị, bechapụ anụ ahụ akwụkwọ na dayameta nke 2-3mm ma tinye ya na usoro mmeghachi omume PCR.
Mara: Gbaa mbọ hụ na etinyere iberibe akwụkwọ ndị ahụ kpamkpam na ngwọta mmeghachi omume PCR, ma etinyekwala anụ ahụ akwụkwọ oke oke.
5.2: Usoro lysis akwukwo
Bee anụ ahụ akwụkwọ ahụ na dayameta nke 5-7mm ma tinye ya na tube centrifuge.Ọ bụrụ na ịhọrọ akwụkwọ toro eto, biko zere iji anụ ahụ nke isi akwara nke akwukwo.Pipette 50ul Buffer P1 lysate n'ime tube centrifuge iji hụ na lysate nwere ike imikpu anụ ahụ akwụkwọ ahụ kpamkpam, tinye ya na cycler thermal ma ọ bụ igwe bat, na lyse na 95 ° C maka nkeji 5-10.
Tinye 50ul Buffer P2 ngwọta neutralization ma gwakọta nke ọma.Enwere ike iji lysate pụta dị ka ndebiri ma tinye ya na usoro mmeghachi omume PCR.
Rịba ama: Ọnụ ego nke ndebiri kwesịrị ịdị n'etiti 5-10% nke usoro PCR, ma ghara ịgafe 20% (dịka ọmụmaatụ, na usoro 20μl PCR, tinye 1-2μl nke lysis buffer, ọ bụghị karịa 4μl).
Kwụpụ 6: Mmeghachi omume PCR
Mgbe centrifu na PCR mmeghachi omume tube, tinye ha na PCR ngwá maka nkwalite.
Mara:
Mmeghachi omume na-eji ndebiri na-adịghị ọcha maka mmụba, ya mere ọnụ ọgụgụ nke nkwuputa cycles bụ 5-10 ọzọ cycles karịa mgbe ị na-eji ụdị DNA dị ọcha.
Kwụpụ 7: Nchọpụta Electrophoresis na nyocha nsonaazụ
M: 100bp DNA Ladder
1\4: Usoro DNA dị ọcha
2\5: Usoro PCR ozugbo
3\6: njikwa oghere
Njikwa ogo:
Nsonaazụ ule nke njikwa dị iche iche edobere na nnwale kwesịrị izute ọnọdụ ndị a.Ma ọ bụghị ya, a ga-enyocha ihe kpatara nsogbu ahụ, a ga-emekwa ule ahụ ọzọ mgbe ewepụsịrị nsogbu ahụ.
Tebụl 1. Nnwale ule nkịtị nke otu njikwa dị iche iche
* Mgbe ejiri plasmid mee ihe dị ka njikwa dị mma, nsonaazụ mkpụrụ ndụ ihe nketa endogenous nwere ike ịdị njọ
Mkpebi nsonaazụ:
A. Nsonaazụ nke mkpụrụ ndụ ihe nketa endogenous nke ihe nlele ahụ adịghị mma, na-egosi na DNA nke dabara maka nchọpụta PCR nkịtị enweghị ike isi na nlele ahụ pụta ma ọ bụ DNA ahụ ewepụtara nwere ihe mgbochi mmeghachi omume PCR, na DNA kwesịrị iwepụtaghachi ọzọ.
B. Nnwale ule nke mkpụrụ ndụ ihe nketa endogenous nke ihe nlele ahụ dị mma, na nsonaazụ ule nke exogenous gene bụ ihe na-adịghị mma, na-egosi na DNA dabara adaba maka nchọpụta PCR nkịtị na-esi na ihe nlele ahụ pụta, enwere ike ikpebi na achọpụtaghị mkpụrụ ndụ XXX na nlele ahụ.
C. Nsonaazụ nke mkpụrụ ndụ ihe nketa endogenous nke ihe nlele ahụ dị mma, na nsonaazụ nnwale nke exogenous gene dị mma, na-egosi na DNA dabara adaba maka nchọpụta PCR nkịtị ka esitere n'ihe nlele ahụ, DNA sample nwere mkpụrụ ndụ XXX.Enwere ike ịmekwu nnwale nkwenye.
Nzọụkwụ 8: Imepụta primers
Mgbe nnwale ahụ gasịrị, jiri 2% sodium hypochlorite solution na 70% ethanol ngwọta hichapụ ebe nnwale iji gbochie mmetọ gburugburu ebe obibi.
Ihe mgbakwunye
Tebụl 2. primers ndị a na-ejikarị eme ihe maka nchọpụta PCR n'ozuzu nke osisi ndị gbanwere mkpụrụ ndụ ihe nketa
Akwụkwọ ntụaka:
SN/T 1202-2010, Usoro nchọpụta PCR dị mma maka ihe ọkụkụ gbanwere mkpụrụ ndụ ihe nketa na nri.
Ozi nke Ministry of Agriculture 1485-5-2010, Nnwale nke ihe mejupụtara mkpụrụ ndụ ihe nketa osisi na ngwaahịa ha- osikapa M12 na usoro ya.
Oge nzipu: Jun-09-2021
