1. Ihe ọmụma bụ isi (ọ bụrụ na ịchọrọ ịhụ akụkụ nnwale, biko nyefee ozugbo na akụkụ nke abụọ)
Dị ka a ewepụtara mmeghachi omume nke ot PCR, Real oge PCR tumadi Monitors mgbanwe nke ego nke amplification ngwaahịa na nke ọ bụla okirikiri nke PCR amplification mmeghachi omume na ozugbo site mgbanwe nke fluorescence mgbaàmà, na quantitatively nyochaa mmalite template site mmekọrịta n'etiti ct uru na ọkọlọtọ usoro.
A kapịrị ọnụ data nke RT-PCR bụndabere, fluorescence ọnụ ụzọnaCt uru.
| ndabere: | Uru fluorescence nke okirikiri nke 3rd-15 bụ ntọala (baseline), nke na-akpata site na njehie oge ụfọdụ nke nha. |
| Oke (ọnụ ụzọ): | Na-ezo aka na oke nchọta fluorescence nke edobere n'ọnọdụ kwesịrị ekwesị na mpaghara uto nkwuputa nke mgbago nkwalite, n'ozuzu ugboro iri ngbanwe ọkọlọtọ nke ntọala ntọala. |
| Uru CT: | Ọ bụ ọnụọgụ PCR mgbe uru fluorescence dị na tube mmeghachi omume ọ bụla rutere n'ọnụ ụzọ. Uru Ct dabara na ọnụọgụ nke ndebiri mbụ. |
Ụzọ ntinye aha na-adịkarị maka RT-PCR:
| usoro | uru | adịghị ike | akporo ngwa |
| SYBR Green Ⅰ | Ngwa zuru oke, dị nro, dị ọnụ ala na adaba | Ihe ndị chọrọ nke mbụ dị elu, na-adịkarị mfe maka eriri ndị na-abụghị nke akọwapụtara | Ọ dabara maka nyocha ọnụọgụ nke mkpụrụ ndụ ihe nketa dị iche iche, nyocha gbasara mkpụrụ ndụ ihe nketa, na nyocha banyere anụmanụ na osisi transgenic recombinant. |
| TaqMan | Ezi nkọwa na elu repeatability | Ọnụahịa ahụ dị elu ma dabara naanị maka ebumnuche ụfọdụ. | Nchọpụta ihe na-akpata ọrịa, nchọpụta mkpụrụ ndụ ihe nketa na-eguzogide ọgwụ, nyocha nrụpụta ọgwụ, nchọpụta ọrịa mkpụrụ ndụ ihe nketa. |
| mgbama molekụla | Nkọwa dị elu, fluorescence, ndabere dị ala | Ọnụ ego dị elu, ọ bụ naanị maka otu nzube, nhazi ahụ siri ike, ọnụahịa ahụ dịkwa elu. | Nyocha mkpụrụ ndụ ihe nketa akọwapụtara, nyocha SNP |
2. Usoro nnwale
2.1 Banyere nchịkọta nnwale-A ga-enwerịrị ọtụtụ olulu mmiri n'ìgwè ahụ, a ga-enwekwa ikwugharị ihe ndị dị ndụ.
| ① | Njikwa oghere | Ejiri ya chọpụta ọkwa uto cell na nnwale |
| ② | SiRNA njikwa adịghị mma (usoro siRNA na-abụghị nke akọwapụtara) | Gosipụta nkọwapụta nke omume RNAi.siRNA nwere ike iweta nzaghachi nrụgide na-enweghị isi na ntinye nke 200nM. |
| ③ | Njikwa Reagent Nfefe | Wepụ nsí nke reagent nfefe na sel ma ọ bụ mmetụta na ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ. |
| ④ | siRNA megide mkpụrụ ndụ ebumnuche | Kụtuo okwu nke mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ |
| ⑤ (nhọrọ) | ezigbo siRNA | A na-eji ya dozie usoro nnwale na nsogbu arụ ọrụ |
| ⑥ (nhọrọ) | Fluorescent akara siRNA | Enwere ike ịhụ arụmọrụ nke nnyefe cell site na microscope |
2.2 Ụkpụrụ nke imewe primer
| Nha iberi agbasawanye | Ọ kachasị mma na 100-150bp |
| Ogologo mbido | 18-25 bp |
| GC ọdịnaya | 30%-70%, ọkachamma 45%-55% |
| Tm uru | 58-60 ℃ |
| Usoro | Zere T / C na-aga n'ihu;A/G na-aga n'ihu |
| 3 usoro ngwụcha | Zere ọgaranya GC ma ọ bụ AT ọgaranya;ọdụ ọdụ kacha mma G ma ọ bụ C;ọ kacha mma izere T |
| Mmeju | Zere usoro mmekọ nke ihe karịrị ntọala atọ n'ime primer ma ọ bụ n'etiti primer abụọ |
| Nkọwapụta | Jiri nchọta gbawara agbawa iji kwado nkọwapụta ngwa ngwa |
①SiRNA bụ ụdị-kpọmkwem, na usoro nke ụdị dị iche iche ga-adị iche.
② A na-akwakọba SiRNA na ntụ ntụ akpọnwụrụ akpọnwụ, nke enwere ike ịchekwa ya nke ọma maka izu 2-4 n'ime ụlọ okpomọkụ.
2.3 Ngwaọrụ ma ọ bụ reagents nke kwesịrị ịkwado n'ọdịnihu
| Primer (ntụgharị aka nke ime) | Gụnyere n'ihu na azụ abụọ |
| Primers (ndụmọdụ ebumnuche) | Gụnyere n'ihu na azụ abụọ |
| Ebumnuche Si RNA (iberibe 3) | N'ozuzu, ụlọ ọrụ ahụ ga-emepụta ibe 3, wee họrọ otu n'ime atọ site na RT-PCR |
| Ngwa nnyefe | Lipo2000 wdg. |
| Ngwa ngwa mmịpụta RNA | Maka mmịpụta RNA mgbe mbufechara |
| Ngwa ntụgharị ngwa ngwa | maka njikọ cDNA |
| Ngwa PCR Amplification | 2 × Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Banyere okwu ndị dị mkpa ka elele anya na usoro nnwale ndị akọwapụtara:
① usoro mbufe siRNA
1. N'ihi na plating, ị nwere ike họrọ 24-ọma efere, 12-ọma efere ma ọ bụ 6-ọma efere (nkezi RNA ịta tụrụ aro na nke ọ bụla nke ọma nke a 24-ọma efere bụ banyere 100-300 ng / uL), na ezigbo njupụta njupụta nke mkpụrụ ndụ bụ ruo 60% -80% ma ọ bụ karịa.
2. Usoro ntụgharị na ihe ndị a kapịrị ọnụ bụ nke siri ike dịka ntuziaka.
3. Mgbe mbufefechara, enwere ike ịnakọta ihe nlele n'ime awa 24-72 maka nchọpụta mRNA (RT-PCR) ma ọ bụ nchọpụta protein n'ime awa 48-96 (WB)
② Usoro mmịpụta RNA
1. Gbochie mmetọ site na exogenous enzymes.Ọ na-agụnye iyi ihe mkpuchi na uwe aka nke ọma;iji ntuziaka pipette igba ogwu na tube EP;mmiri a na-eji na nnwale ga-abụrịrị RNase-efu.
2. A na-atụ aro ime ugboro abụọ dị ka a tụrụ aro na ngwa ngwa mmịpụta ngwa ngwa, nke ga-eme ka ịdị ọcha na mkpụrụ dị mma n'ezie.
3. Mmiri mmiri mkpofu ekwesịghị imetụ kọlụm RNA aka.
③ ọnụọgụ RNA
Mgbe ewepụtachara RNA, enwere ike iji Nandrop tụọ ya ozugbo, yana ọgụgụ kacha nta nwere ike ịdị obere ka 10ng/ul.
④ Usoro ntụgharị ntụgharị
1. N'ihi uche dị elu nke RT-qPCR, ọ dịkarịa ala 3 olulu mmiri kwesịrị ime maka nlele ọ bụla iji gbochie Ct na-esote dị iche iche ma ọ bụ SD ka ọ buru ibu maka nyocha ọnụ ọgụgụ.
2. Akwụsịla ma kpoo Master mix ugboro ugboro.
3. A ghaghị dochie tube / oghere ọ bụla na ntinye ọhụrụ!Ejila otu n'ọnụ pipette ahụ na-aga n'ihu iji tinye ihe nlele!
4. Ihe nkiri a na-ejikọta na efere 96 nke ọma mgbe ị gbakwunyere ihe nlele ahụ kwesịrị ka a na-edozi ya na efere.Ọ kacha mma ka centrifuge tupu etinye ya na igwe, nke mere na mmiri mmiri dị na mgbidi tube nwere ike ịdaba ma wepụ ikuku ikuku.
⑤ Ntụle nhịahụ nkịtị
| Enweghị oge uto logarithmic | Enwere ike itinye uche dị elu nke ndebiri |
| Enweghị uru CT | Nzọụkwụ ezighi ezi maka ịchọpụta akara fluorescent; mmebi nke primers ma ọ bụ nyocha - iguzosi ike n'ezi ihe ya nwere ike ịchọpụta site na PAGE electrophoresis; ezughị oke nke ndebiri; nbibi nke ndebiri - na-ezere iwebata adịghị ọcha na oyi na-atụ ugboro ugboro na thawing na nkwadebe sample; |
| ct>38 | Obere nkwalite arụmọrụ;Ngwaahịa PCR dị ogologo;dị iche iche mmeghachi omume akụkụ na-eweda |
| Usoro mmụba nke ahịrị | Enwere ike mebie nyocha nke ụfọdụ site na okirikiri oyi na-ekpo ọkụ ugboro ugboro ma ọ bụ ikpughe ogologo oge na ìhè. |
| Ọdịiche dị na oghere oyiri buru oke ibu | Ngwọta mmeghachi omume adịghị agbaze kpamkpam ma ọ bụ ngwakọta mmeghachi omume adịghị agwakọta;A na-emerụ bath thermal nke ngwa PCR site na ihe fluorescent |
2.5 Banyere nyocha data
Enwere ike kewaa nyocha data nke qPCR ka ọ bụrụ nha nha na nha zuru oke.Dịka ọmụmaatụ, mkpụrụ ndụ n'ime otu ọgwụgwọ ma e jiri ya tụnyere mkpụrụ ndụ n'ime otu njikwa,
Ugboro ole mRNA nke mkpụrụ ndụ X na-agbanwe, nke a bụ nha nha anya;n'ime ọnụ ọgụgụ ụfọdụ nke mkpụrụ ndụ, mRNA nke mkpụrụ ndụ X
Kedu ụdị nke enwere, nke a bụ ọnụọgụ zuru oke.Ọtụtụ mgbe, ihe anyị na-ejikarị na ụlọ nyocha bụ usoro ọnụọgụ ọnụọgụ.Ọtụtụ mgbe,usoro 2-ΔΔcta na-ejikarị eme ihe na nnwale, yabụ naanị usoro a ka a ga-ewebata n'ụzọ zuru ezu ebe a.
Usoro 2-ΔΔct: Nsonaazụ enwetara bụ ọdịiche dị na ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ na otu nnwale metụtara mkpụrụ ndụ ebumnuche na otu njikwa.A na-achọrọ na arụmọrụ mmụba nke ma mkpụrụ ndụ ebumnuche yana mkpụrụ ndụ nrụtụ aka dị n'ime dị nso 100%, na ngbanwe nke ikwu ekwesịghị gafere 5%.
Usoro mgbako bụ nke a:
Otu njikwa Δct = ct uru nke mkpụrụ ndụ ebumnuche na otu njikwa - ct uru nke mkpụrụ ndụ ihe n'ime n'ime otu njikwa
Otu nnwale Δct = ct uru nke mkpụrụ ndụ ebumnuche na otu nnwale - uru ct nke mkpụrụ ndụ ihe nleba anya n'ime otu nnwale.
ΔΔct = Δct nnwale otu-Δct otu njikwa
N'ikpeazụ, gbakọọ ọtụtụ ihe dị iche na ọkwa okwu:
Gbanwee folda = 2-ΔΔct (dakọtara na ọrụ excel bụ IKE)
Ngwaahịa ndị emetụtara:
Oge nzipu: Mee-20-2023
