Na nyocha qPCR, imewe primer bụkwa njikọ dị oke mkpa.Ma primers adabara ma ọ bụ na ọ bụghị na ọ nwere njikọ chiri anya ma arụmọrụ nkwalite erutela ọkọlọtọ, ma ngwaahịa ndị a kapịrị ọnụ akọwapụtara, yana ma nsonaazụ nnwale dị.
Yabụ kedu ka esi eme ka qPCR primer specificity ka mma?Ịrụ ọrụ nkwalite dị elu?
Taa, anyị ga-akpọrọ gị chepụta qPCR primers ọnụ, ma hapụ qPCR primer design ka ọ bụrụ nka na-arụ ọrụ nke ọma na nnwale.
Mgbe ị na-emepụta qPCR primers, na-aṅakarị ntị na isi ihe ndị a: ekwesịrị ịmepụta primers gafee introns dị ka o kwere mee, ogologo ngwaahịa ahụ kwesịrị ịbụ 100-300 bp, uru Tm kwesịrị ịdị nso dị ka o kwere mee na 60 Celsius C, na elu na elu ala kwesịrị ịdị nso dị ka o kwere mee, na njedebe nke primer kwesịrị ịbụ G ma ọ bụ C, wdg.
1. Nhazi nke primers spaning introns
Mgbe ị na-emepụta primers qPCR, ịhọrọ primers emebere n'ofe introns nwere ike igbochi ndebiri gDNA ịgbasawanye, na ngwaahịa ndị a sitere na nkwalite cDNA, si otú a na-ewepụ mmetụta nke mmetọ gDNA.
2. Ogologo mbido
Ogologo primer na-adịkarị n'etiti 18-30 nt, na ogologo ngwaahịa mmụba kwesịrị ịchịkwa n'etiti 100-300 bp dị ka o kwere mee.
Ọ bụrụ na primer dị mkpụmkpụ, ọ ga-eduga na mmụba na-abụghị nke a kapịrị ọnụ, ma ọ bụrụ na ọ dị ogologo, ọ ga-adị mfe ịmepụta usoro nke abụọ (dịka nhazi ntutu isi).Ọ bụrụ na ngwaahịa nkwalite ahụ dị ogologo, ọ dịghị mma maka mmeghachi omume nke polymerase, nke ga-emetụta arụmọrụ nke PCR amplification.
3. Ọdịnaya GC na uru Tm
Ekwesịrị ịchịkwa ọdịnaya GC nke primers n'etiti 40% na 60%.Ọ bụrụ na ọ dị oke elu ma ọ bụ dị ala, ọ dịghị mma ịmalite mmeghachi omume.Ọdịnaya GC nke primers na-aga n'ihu na nke azụ kwesịrị ịdị nso otu ihe iji nweta otu uru Tm na okpomọkụ na-ekpo ọkụ.
Ọnụ ego Tm kwesịrị ịdị n'etiti 55-65 Celsius dị ka o kwere mee, n'ozuzu gburugburu 60 Celsius, na uru Tm nke elu na mgbada kwesịrị ịdị nso dị ka o kwere mee, ọkachamma ọ bụghị ihe karịrị 4 Celsius.
4. Zere ịhọrọ A na njedebe 3′ nke primer
Mgbe njedebe 3 ′ nke primer na-adaghị adaba, enwere nnukwu ọdịiche dị na njikọ njikọ nke ntọala dị iche iche.Mgbe ntọala ikpeazụ bụ A, ọ nwekwara ike ịmalite njikọ nke yinye ọbụna n'ọnọdụ nke na-adịghị mma, na mgbe njedebe ikpeazụ bụ T Mgbe , arụmọrụ nke ntinye ntinye na-ebelata nke ukwuu.Ya mere, gbalịa izere ịhọrọ A na njedebe 3′ nke primer, ma ọ ka mma ịhọrọ T.
Ọ bụrụ na ọ bụ primer nyocha, njedebe 5′ nke nyocha ahụ enweghị ike ịbụ G, n'ihi na ọbụlagodi mgbe ejikọtara otu G base na FAM fluorescent reporter group, G nwekwara ike imenyụ mgbama fluorescent nke otu FAM na-ewepụta, na-ebute nsonaazụ ọjọọ ụgha.Apụta.
5. Nkesa ntọala
Nkesa nke ntọala anọ na primer bụ ọkachamma na-enweghị usoro, na-ezere ihe karịrị 3 consecutive G ma ọ bụ C na njedebe 3′, yana karịa 3 n'usoro.G ma ọ bụ C dị mfe ịmepụta njikọta na mpaghara usoro bara ụba nke GC.
6. Mpaghara imewe primer kwesịrị izere ihe owuwu nke abụọ dị mgbagwoju anya.
Nhazi nke abụọ nke otu eriri nke ngwaahịa nkwalite ga-emetụta ọganihu dị mma nke PCR.Site n'ịkọ ma enwere usoro nke abụọ na usoro ebumnuche n'ọdịnihu, gbalịa izere mpaghara a na nhazi nke primers.
7. The primers n'onwe ha na n'etiti primers kwesịrị ịgbalị izere usoro nkwado ndabere.
Enweghị ike inwe mmekọ ntọala 4 sochiri anya n'etiti primer n'onwe ya na primer.Onye na-emepụta ihe n'onwe ya ekwesịghị inwe usoro mgbakwunye, ma ọ bụghị ya, ọ ga-apịaji onwe ya iji mepụta nhazi ntutu isi, nke ga-emetụta nchikota annealing nke primer na template.
Usoro mmekọ enweghị ike ịdị n'etiti mbido elu na nke mgbada.Mmekọrịta dị n'etiti primers ga-emepụta primer dimers, nke ga-ebelata arụmọrụ PCR na ọbụna na-emetụta ọnụ ọgụgụ ziri ezi.Ọ bụrụ na usoro primer-dimer na ntutu isi bụ ihe a na-apụghị izere ezere, uru △G ekwesịghị ịdị elu (kwesịrị ịbụ ihe na-erughị 4.5 kcal / mol).
8. The primers na-amụba ebumnobi kpọmkwem ngwaahịa.
Ebumnuche kachasị nke nchọpụta qPCR bụ ịghọta ụbara mkpụrụ ndụ ihe nketa ebumnuche.Ọ bụrụ na nkwalite na-abụghị nke akọwapụtara emee, ọnụọgụ ga-abụ ezighi ezi.Ya mere, mgbe emechara primers, ọ dị mkpa ka a nwalee ha site na BLAST, na nkọwapụta nke ngwaahịa ndị a na-atụnyere na nchekwa data usoro.
Ọzọ, anyị na-ewere GAS6 mmadụ (Growth jidere kpọmkwem 6) gene dị ka ihe atụ iji chepụta qPCR primers.
01 gene ajụjụ
Homo GAS6site na NCBI.N'ebe a, anyị kwesịrị ịṅa ntị n'ịtụle aha mkpụrụ ndụ ihe nketa na ụdị iji hụ na ha na-agbanwe agbanwe.
02 Chọta usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa
(1) Ọ bụrụ na usoro ebumnuche bụ DNA genomic, họrọ nke mbụ, nke bụ usoro DNA genomic nke mkpụrụ ndụ ihe nketa.
(2) Ọ bụrụ na usoro ebumnuche bụ mRNA, họrọ nke abụọ.Mgbe ịbanyechara, pịa “CDS” na tebụl dị n'okpuru.Usoro ndabere agba aja aja bụ usoro ntinye nke mkpụrụ ndụ ihe nketa.
03 Imepụta primers
Tinye ngwa ngwa-BLAST interface
Tinye nọmba usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa ma ọ bụ usoro n'usoro Fasta n'elu aka ekpe, wee dejupụta paramita dị mkpa.

Pịa "Nweta primers" na NCBI ga-apụta ịgwa gị na a ga-eme ka nhọrọ oke dị otú ahụ dịkwuo n'ụdị ndị ọzọ.Anyị nwere ike ịlele ụdị splicing dị iche iche ma nyefee ha iji nweta ụzọ primer kwesịrị ekwesị (dị ka egosiri na foto dị n'okpuru).Usoro a nwere ike were nkeji iri iri iji gbaa ọsọ.
Okpomọkụ na-ekpo ọkụ nke ụzọ abụọ mbụ ndị a na-adị gburugburu 60 Celsius.Dị ka nzube nke nnwale, họrọ primers na agafeghị oke ogologo, ezi nkọwa na obere onwe-mmeju nke primers maka nnwale, na ihe ịga nke ọma ọnụego bụ nnọọ elu!
04 Nnwale nkọwapụta nke izizi
N'ezie, na mgbakwunye na ịmepụta primers, Primer-Blast nwekwara ike nyochaa primers anyị mere onwe anyị.Laghachi na ibe imewe primer, tinye ihe nrịbama elu na nke mgbada anyị haziri, agaghị agbanwekwa paramita ndị ọzọ.Mgbe emechara ya, ị ga-ahụ ma ụzọ abụọ ahụ dịkwa na mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị ọzọ.Ọ bụrụ na egosipụtara ha niile na mkpụrụ ndụ ihe nketa anyị chọrọ ịgbasawanye, na-egosi na nkọwapụta nke ụzọ abụọ a dị oke mma!(Dịka ọmụmaatụ, nke a bụ naanị nsonaazụ nke ajụjụ mbụ!)

05 Mkpebi kacha mma
Kedu ụdị primer bụ "ezigbo" primer na-ejikọta "nrụmọrụ nkwalite ruo ọkọlọtọ", "njirimara ngwaahịa agbakwunyere", na "nchọpụta nnwale a pụrụ ịdabere na ya"?
Nkwalite arụmọrụ

agbaze agba
Ịrụ ọrụ nke ọma nke primers ruru 90% -110%, nke pụtara na nkwubi okwu dị mma, na mgbaze na-agbaze nwere otu ọnụ ọgụgụ kasị elu ma na-emekarị Tm> 80 ° C, nke pụtara na nkọwa nkọwa dị mma.
 
Ngwaahịa ndị emetụtara:
Ezigbo oge PCR dị mfe-SYBR GREEN I
Ezigbo oge PCR Easy-Taqman