1. Chọpụta nnabata nke ngwọta RNA
Mwepu na 280, 320, 230, na 260 nm na-anọchite anya ụkpụrụ nke nucleic acid, ndabere (ngwọta ngwọta), ntinye nnu, na ihe ndị dị ndụ dị ka protein, n'otu n'otu.N'ozuzu, lelee naanị OD260/OD280 (Ratio, R).Mgbe 1.8 ~ 2.0, anyị na-eche na mmetọ nke protein ma ọ bụ ihe ndị ọzọ na-emepụta ihe na RNA nwere ike ịnagide, ma ekwesịrị ịmara na mgbe a na-eji Tris dị ka ihe nchekwa iji chọpụta nnabata, uru R nwere ike ịdị ukwuu karịa 2 (n'ozuzu ọ ga-abụ <2.2).Mgbe R<1.8, mmetọ nke protein ma ọ bụ ihe ndị ọzọ na-edozi ahụ na ngwọta bụ ihe doro anya karị, na njedebe nke RNA nwere ike ikpebi dịka mkpa.Mgbe R> 2.2, ọ pụtara na RNA ejirila hydrolyzed n'ime otu nucleic acid.
2.Electrophoretic ụkpụrụ nke RNA
N'ozuzu, a na-eji gel denaturing maka RNA electrophoresis, ma ọ bụrụ na ọ bụ naanị maka ịchọpụta àgwà nke RNA, gel adịghị mkpa, a pụkwara iji gel agarose nkịtị mee ihe.Ebumnuche nke electrophoresis bụ ịchọpụta iguzosi ike n'ezi ihe nke band 28S na 18S na oke ha, ma ọ bụ iguzosi ike n'ezi ihe nke mRNA smear.N'ozuzu, ọ bụrụ na eriri 28S na 18S na-egbuke egbuke, doro anya ma dị nkọ (na-ezo aka na nsọtụ nke eriri ndị ahụ doro anya), na nchapụta nke 28S karịrị okpukpu abụọ nke band 18S, anyị na-ewere àgwà nke RNA dị mma.
Nke a bụ ụzọ abụọ anyị na-ejikarị eme ihe, mana ọ nweghị ụzọ abụọ a nwere ike ịgwa anyị nke ọma ma enwere RNase fọdụrụ na ngwọta RNA.Ọ bụrụ na enwere obere RNase na ngwọta, ọ na-esiri anyị ike ịchọpụta ya na usoro dị n'elu, ma ọtụtụ n'ime mmeghachi omume enzymatic na-esote na-eme n'elu ogo 37 na ogologo oge.N'ụzọ dị otú a, ọ bụrụ na enwere obere RNase na ngwọta RNA, mgbe ahụ, a ga-enwe ebe dị mma na oge iji rụọ ọrụ ha na nyocha ndị na-esote, na n'ezie nnwale ahụ ga-ajụ oyi n'oge a.N'okpuru ebe a, anyị na-ewebata usoro nwere ike igosi ma ọ dị RNase fọdụrụ na ngwọta RNA.
3. Nnwale nchekwa ọkụ
Dị ka nlele nlele ahụ si dị, sere 1000 ng RNA abụọ site na ngwọta RNA wee tinye ya na tube 0.5 ml centrifuge, ma tinye ya na pH 7.0 Tris buffer na mkpokọta 10 ul, wee mechie okpu nke tube ahụ.Tinye otu n'ime ha na mmiri ịsa mmiri na-ekpo ọkụ mgbe niile na 70 Celsius ma mee ka ọ kpoo ọkụ maka 1 h.A na-echekwa akụkụ nke ọzọ na friji -20 Celsius maka 1 h.Mgbe oge gafere, wepụ ihe abụọ maka electrophoresis.Mgbe emechara electrophoresis, tulee eriri electrophoretic nke abụọ ahụ.Ọ bụrụ na eriri abụọ ahụ na-agbanwe agbanwe ma ọ bụ enweghị ọdịiche dị ịrịba ama (n'ezie, ndị otu ha na-ezutekwa ọnọdụ dị na usoro 2), ọ pụtara na ọ dịghị mmerụ RNase fọdụrụnụ na ngwọta RNA, na àgwà RNA dị ezigbo mma.N'ụzọ megidere nke ahụ, ọ bụrụ na ihe nlele ahụ etinyere na 70 Celsius C na-egosi mmebi doro anya, ọ na-egosi na enwere mmetọ RNase na ngwọta RNA.
2 Ụzọ nnwale na usoro maka mmịpụta RNA
Nsogbu ndị anyị na-enwekarị mgbe anyị na-ewepụta RNA bụ: (1) mkpụrụ RNA dị obere;(2) RNA nwere nnukwu mmetọ nnu;(3) RNA nwere ajọ mmetọ ihe mgbaze organic;(4) sample mmebi na nsogbu ndị ọzọ
1. Ngụkọta mmịpụta RNA a na-ejikarị
Usoro guanidine isothiocyanate na usoro Trizol bụ ụzọ a na-ejikarị eme ihe maka mmịpụta mkpokọta RNA site na anụ ahụ anụmanụ na mkpụrụ ndụ anụmanụ.Ọ dabara nke ọma maka obere ihe nlele na anụ ahụ siri ike ịwepụta, dị ka mmịpụta RNA mkpokọta sitere na akpụkpọ oke bekee na anụ ahụ njikọ anụ;na mgbakwunye, Trizol, dị ka a n'ozuzu nzube lysis reagent, nwekwara ike-eji maka mmịpụta nke osisi anụ ahụ, nje bacteria, fungi na ndị ọzọ na anụ ahụ.Maka anụ ahụ osisi nwere polysaccharides na polyphenols, dị ka camellia oleifera, akwụkwọ tii, rapeseed, wdg, a pụkwara iji usoro CTAB wepụ mkpokọta RNA.
Dị ka usoro a na-emekarị, usoro kọlụm abụọ na-ewu ewu n'ihi ọrụ okpomọkụ ya, ọ dịghị mkpa ịgbakwunye RNase, na nchekwa-enweghị chloroform, phenols na ihe ndị ọzọ na-emepụta ihe na-emepụta ihe.(akwadoro ngwaahịa )
2. Mwepu nke mkpokọta RNA site na anụ ahụ anụmanụ
(1) Gbalịa ịhọrọ anụ ahụ dị ọhụrụ, ma ọ bụrụ na ọ bụghị ọhụrụ (ọkacha mma n'ime ọnwa atọ - 80 ℃ refrjiraeto ma ọ bụ oyi kpọnwụrụ na mmiri mmiri nitrogen. Mgbe ị na-egbutu anụ ahụ, egbula ozugbo na ụlọ okpomọkụ, jide n'aka na ị ga-etinye ya na igbe ice, gbalịa ka ịzere oyi na thawing ugboro ugboro.
(2) Jiri mkpa dị ọcha na tweezers gbutuo obere anụ ahụ, gbalịa ịkpụ akụkụ etiti anụ ahụ mgbe ị na-egbutu ihe nlele ahụ, ma ọ bụ buru ụzọ bee nnukwu anụ ahụ n'etiti, wee bechapụ ihe nlele ahụ n'ọnọdụ mkpọpu ọhụrụ.A na-ewepụ anụ ahụ nke e wepụrụ n'ụzọ zuru ezu, tinye anụ ahụ a kpụkọrọ akpụkọ n'ime tube EP na-enweghị RNase, gbakwunye lysate, anụ ahụ na-ekpo ọkụ ga-ekpuchi ya nke ọma na lysate, ma kwadebe maka homogenization.
(3) Maka anụ ahụ nkịtị, họrọ anụ ahụ nwere oke agwa (30-60 mg) maka imekọ ihe.Ọ bụrụ na anụ ahụ nwere nnukwu protein, abụba, ma ọ bụ anụ ahụ fibrous dị ka imeju, na-abawanye ma ọ bụ belata nke ọma nke anụ ahụ (nhọrọ) Họrọ 10 ~ 20 mg).
(4) Ọ bụrụ na a na-ewepụta ahụ ike azụ, anụ shrimp, jellyfish na anụ ndị ọzọ nwere nnukwu mmiri, a ga-abawanye olu nlele nke ọma (100-200 mg kwadoro).
(5) Ọ bụrụ na ọnọdụ kwe, anụ ahụ anụ ahụ nwere ike ozugbo amịpụtara mgbe e homogenized na elu-agafe anụ ahụ homogenizer, ma ọ bụrụ na e nweghị ndị dị otú ahụ ngwá.
(6) A ghaghị itinye RNA nke enwetara mgbe mmịpụta ikpeazụ ga-etinye na igbe ice ozugbo iji belata nbibi nke RNA.
3. Mwepụta RNA anụ anụmanụ
(1) Mkpụrụ ndụ nkwusioru: centrifuge ozugbo ma tụfuo ọkara, saa ya na PBS na-adịghị mma maka oge 1-2, wee kwụsịtụ ya na PBS kwesịrị ekwesị, wee tinye lysate maka lysis.Akwụsịla lysate ozugbo na sel ndị na-ebuli elu mgbe ị tụfuru mmiri mmiri kpamkpam.Nke a ga-eme ka ngwugwu histone pụta mgbe mkpụrụ ndụ lysed dị na oyi akwa dị n'èzí na-arapara n'èzí nke sel ndị ahụ, si otú ahụ na-egbochi kọntaktị nke mkpụrụ ndụ n'ime pellet na lysate., na-ebute lysis cell ezughị ezu na mbelata mkpụrụ RNA.
(2) Sel ndị na-emechi emechi ma ọ bụ na-akwadoghị nke ọma: Mgbe ị tụfuchara usoro ahụ, jiri PBS sachaa ugboro 1-2, wee banye kpọmkwem PBS kwesịrị ekwesị ma jiri pipette ma ọ bụ egbe fesaa efere omenala iji kpochapụ mkpụrụ ndụ, ma bufee ha na sel ndị na-enweghị RNA.Tinye lysate na tube EP nke enzyme maka mmịpụta.
(3) sel ndị na - ejikọta: mkpa ka a gbarie ya na trypsin na mbụ, wee kpokọta ya na tubes EP na-enweghị RNase, centrifuged iji wepụ ihe dị elu, saa 1-2 ugboro na PBS iji wepụ ngafe trypsin, ma weghachite ya na PBS kwesịrị ekwesị wee gaa n'ihu na nzọụkwụ mmịpụta.
4. Mwepụta RNA osisi
Anụ ahụ osisi nwere ọgaranya na ogige phenolic, ma ọ bụ ọgaranya na polysaccharides, ma ọ bụ nwere ụfọdụ metabolites nke abụọ na-amaghị ama, ma ọ bụ nwere nnukwu ọrụ nke RNase.A na-ejikọta ihe ndị a na RNA mgbe sel lysis gasịrị na-etolite mgbagwoju anya ma ọ bụ colloidal precipitates, nke siri ike iwepụ.Ya mere, mgbe anyị wepụrụ anụ ahụ osisi, anyị kwesịrị ịhọrọ ngwa maka osisi.The lysate na kit nwere ike nke ọma dozie nsogbu nke mfe oxidation nke polyphenols na nkewa nke polysaccharide ogige na nucleic acid.
(Maka polysaccharide polyphenol osisi RNA mmịpụta, ngwaahịa akwadoro:
(1) Peel, pulp, mkpụrụ, akwụkwọ na ihe ndị ọzọ nke osisi ahụ kwesịrị ịwụcha ya nke ọma na ngwa ngwa.N'oge usoro egweri, nitrogen mmiri mmiri kwesịrị imeju n'oge iji zere ịgbaze ihe nlele ahụ.Ekwesịrị ịgbakwunye ihe nlele ala ngwa ngwa na lysate ma maa jijiji ka ọ ghara imebi RNA.
(2) Maka ihe atụ ndị nwere eriri dị ka osikapa na akwụkwọ ọka wit, a ga-ebelata ọnụ ọgụgụ nke mmịpụta nke ọma, ma ọ bụghị ya, anụ ahụ na-egweri na lysis agaghị ezu ezu, na-ebute obere mkpụrụ nke RNA a na-amịpụta.
(3) Maka anụ ahụ osisi nwere mmiri dị elu, dị ka mkpụrụ pọmigranet, mkpụrụ osisi anyụ, mkpụrụ osisi peach, wdg, a ga-abawanye nha nha nke ọma (100-200 mg bụ nhọrọ).
(4) A na-atụ aro anụ ahụ dị ka akwụkwọ osisi, rhizomes, mkpụrụ osisi siri ike na ihe ndị ọzọ ka ha jiri nitrogen mmiri mmiri mee ka ihe ndị dị na ngwa agha na-agbapụta nke ọma, wee gaa n'ihu na nzọụkwụ mmịpụta.Conventional anụ ahụ homogenizers nwere ike ghara ịdị irè na homogenizing osisi anụ ahụ, na n'ozuzu adịghị atụ aro.
5. Akpachara anya maka mmịpụta RNA
(1) Ihe nlele anụ ahụ kwesịrị ịdị ọhụrụ dị ka o kwere mee ka ịzenarị oyi na agbaze ugboro ugboro.
(2) Anụ ahụ kwesịrị ịbụ nke ọma n'ala n'oge mmịpụta, na ọnụ ọgụgụ anụ ahụ ekwesịghị ịdị ntakịrị, ma ọ bụghị naanị ya.
(3) Ekwesịrị inye oge ntinye oge zuru oke mgbe ị gbakwunyere lysate iji mebie ihe nlele ahụ.
(4) Mgbe ị na-eji usoro Trizol maka mmịpụta, ụkpụrụ nke ịmịnye supernatant mgbe stratification bụ "ọ ga-amasị gị iku ume na-erughị iku ume karịa", ma ọ gaghị ewepụ ya na oyi akwa etiti, ma ọ bụghị ya, ọ ga-eme ka nje DNA dị njọ.
(5) Mgbe ị na-asa ahụ, mmiri ịsa ahụ kwesịrị ịbanye n'ụzọ zuru ezu na mgbidi tube iji hụ na ịsa ya nke ọma.
(6) Maka usoro mmịpụta kọlụm, na mgbakwunye na ịwepụ kọlụm ahụ mgbe ịsachara, a ga-etinyekwa kọlụm adsorption na bench dị ọcha ma fụọ ya maka nkeji 5-10 iji kpochapụ ihe mgbaze organic na nkụ.
(7) N'ikpeazụ elution nke usoro kọlụm, mgbe ị gbakwunyere mmiri DEPC, a ga-etinye ya maka nkeji 3-5, ma ọ bụ mmiri DEPC ga-ekpo ọkụ ruo 60 ° C tupu oge eruo iji mee ka elution pụta.Na omenala Trizol cleavage na isopropanol usoro mmiri ozuzo, RNA ikpeazụ na-agbaze na mmiri DEPC, n'ihi ya, a ga-enye oge kwesịrị ekwesị maka mgbasa, na ala nke centrifuge tube kwesịrị ka a na-awụpụ ya n'ọnụ ọnụ pipette.
3 Three Ihe na-akpata na ngwọta maka obere RNA itinye uche / adịghị mma
1. Mkpụrụ dị oke ala
Ihe nlele amịpụtara dị oke ala, ngụkọta ego ezughị oke, ma ọ bụ ihe amịpụtara dị oke ma lysis ezughị oke;A ghaghị iji anụ ahụ ma ọ bụ sel nke àgwà kwesịrị ekwesị mee ihe maka mmịpụta, a ghaghị ime ọgwụgwọ tupu ọgwụgwọ nke ihe nlele ahụ nke ọma, na lysis kwesịrị ezuru.
2. Ihe fọdụrụ genome
Mgbe a na-ewepụ ya site na usoro Trizol, mgbe a na-amịpụta ihe dị elu n'ime oyi akwa nke etiti mgbe ọ gbasasịrị, a ga-ebute ajọ ọrịa genome;ekwesịrị iji nlezianya kpachara anya mgbe ị na-akwa akwa ka ịzenarị ịmịnye n'ime oyi akwa etiti.Ọ bụrụ na ejiri usoro kọlụm maka mmịpụta, enwere ike ịhọrọ ngwa nwere DNA I maka mmịpụta.A na-agbari acid nucleic acid na akpụkpọ ahụ ozugbo na DNAse I, nke nwere ike ibelata ihe fọdụrụ DNA nke ukwuu.
3. RNA mmebi
O nwere ike ịbụ nbibi nke ihe nlele amịpụtara n'onwe ya, ma ọ bụ mmebi nke kpatara n'oge usoro mmịpụta;dị ka o kwere mee, a ga-eji ihe nlele ọhụrụ mee ihe maka mmịpụta RNA, a ga-echekwa ihe nlele ndị a chịkọtara na mmiri mmiri nitrogen ma ọ bụ -80 Celsius C n'oge, a ga-ezerekwa oyi na mgbaze ugboro ugboro.Ekwesịrị iji ndụmọdụ efu RNase/DNase, tubes centrifuge na ihe ndị ọzọ na usoro mmịpụta RNA.Usoro mmịpụta kwesịrị ịdị ngwa ngwa o kwere mee.Ekwesịrị idowe RNA ahụ ewepụtara na igbe ice wee chekwaa ya na -80 n'oge.Ọ bụrụ na ekwesịrị ịchọpụta RNA ahụ ewepụtara site na gel electrophoresis, a ga-eme electrophoresis ozugbo ewepụtara ya, a ga-eji nke a kwadebere ọhụrụ dochie ihe nchekwa electrophoresis.
4. Nnu na organic mgbaze residues
Ndị na-emepụta ihe na-emepụta ihe nwere phenol na guanidine salts, na ngwọta ịsa ahụ nwere ethanol.N'oge usoro mmịpụta ahụ, lysate adịghị etinye ya kpam kpam ma tụfuo ya, na ihe ngwọta ịsa ahụ adịghị akpọnwụ kpamkpam.Nnụnụ ndị fọdụrụ na ihe mgbaze organic na-emerụ ahụ maka ntụgharị ntụgharị na PCR na-esote.Ogo dị iche iche nke mgbochi, ya mere ekwesịrị iwepụ lysate anụ ahụ n'ụzọ zuru ezu n'oge usoro mmịpụta, na ịsacha ahụ kwesịrị ekwesị ka e wee nwee ike ịsacha mgbidi gbara ya gburugburu nke tube ahụ.Tụkwasị na nke ahụ, a na-ekpochapụ tube ahụ ma na-afụ ụfụ bụ nzọụkwụ dị mkpa, nke ga-ebelata ihe fọdụrụnụ nke ihe ndị dị ndụ.
Maka ozi ndị ọzọ gbasara mmịpụta RNA, biko soro webụsaịtị anyị:
www.foreivd.com maka ozi ndị ọzọ.
Oge nzipu: Dec-01-2022
