PCR, otutu PCR, N'ime PCR, Mgbanwe PCR, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Anyị ga-edozi echiche, usoro na nkọwa nke PCR dị iche iche

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, nke a na-akpọ PCR, bụ nkà na ụzụ dị ndụ nke a na-eji na-amụba iberibe DNA kpọmkwem.Enwere ike iwere ya dị ka mmụgharị DNA pụrụ iche na vitro.Achọpụtara DNA polymerase (DNA Polymerase I) n'oge dị ka 1955, na Klenow Fragment of E. Coli, nke nwere uru nnwale na ihe bara uru, bụ Dr. H. Klenow chọpụtara na mmalite 1970, ma n'ihi na enzyme a anaghị anabata okpomọkụ, okpomọkụ dị elu nwere ike imebi ya, n'ihi ya, ọ naghị ezute polymerase chain reaction na nnukwu okpomọkụ.Enzymes ndị a na-eji taa (nke a na-akpọ Taq polymerase), dịpụrụ adịpụ na Thermus aquaticus, nje bacteria na-ekpo ọkụ na-ekpo ọkụ na 1976. Njirimara ya bụ na ọ nwere ike iguzogide okpomọkụ dị elu ma bụrụ ezigbo enzyme, ma a na-eji ya eme ihe mgbe 1980 gasịrị.Echiche mbụ nke prototype mbụ nke PCR dị ka nrụzi mkpụrụ ndụ ihe nketa na iṅomi, nke Dr. KJell Kleppe tụpụtara na 1971. O bipụtara mkpụrụ ndụ nke mbụ dị mfe na nke dị mkpirikpi (dị ka mmeghachi omume abụọ mbụ nke PCR).PCR mepụtara taa bụ Dr. Kary B. Mullis mepụtara na 1983. Dr. Mullis jere ozi ụlọ ọrụ PE n'afọ ahụ, ya mere PE nwere ọnọdụ pụrụ iche na ụlọ ọrụ PCR.Dr. Mullis kwadoro akwụkwọ akụkọ mbụ metụtara ya na Saiki na ndị ọzọ na 1985. Kemgbe ahụ, iji PCR eme ihe dị ọtụtụ puku kilomita kwa ụbọchị, a pụkwara ikwu na àgwà nke akwụkwọ ndị metụtara ya na-eme ka ọtụtụ ụzọ nyocha ndị ọzọ na-adịghị mma.Mgbe nke ahụ gasịrị, a na-eji teknụzụ PCR eme ihe n'ọtụtụ ebe na nyocha sayensị sayensị na ngwa ụlọ ọgwụ, na-aghọ teknụzụ kachasị mkpa nke nyocha ihe omimi ihe omimi.Mullis nwetakwara Nrite Nobel na Chemistry na 1993.

PCRỤkpụrụ

Ụkpụrụ bụ isi nke nkà na ụzụ PCR yiri usoro mmegharị eke sitere n'okike nke DNA, nkọwa ya dabere na primer oligonucleotide nke dabara na nsọtụ abụọ nke usoro ebumnuche.PCR mejupụtara degeneration-annealing-ịgbatị usoro mmeghachi omume atọ dị mkpa: ①Degeneration of template DNA: Mgbe DNA template kpụ ọkụ n'ọnụ ruo ihe dị ka 93 Celsius C ruo oge ụfọdụ, ihe ngwọta DNA abụọ maka DNA abụọ-chain kpụrụ site na PCR amplification nke DNA ịhapụ, mee ka ọ bụrụ otu yinye ka e wee nwee ike ijikọ ya na okirikiri na-esote.②Annealing (mgbakwụnye) nke ndebiri DNA na primer: Mgbe DNA template kpụ ọkụ n'ọnụ wee mebie n'ime otu yinye, okpomọkụ na-adaba ihe dịka 55ºC.Usoro nkwado nke primer na ndebiri DNA otu yinye.③ Mgbatị nke primer: DNA template-njikọ nke mbụ dabere na omume nke TaqDNA polymerase, yana dNTP dị ka ngwa mmeghachi omume.Debe ụkpụrụ nke mmegharị, synthesize ọhụrụ ọkara echekwabara yinye yinye nke na-emeju DNA yinye template, na ikwugharị okirikiri degeneration-annealing-extension usoro atọ nwere ike nweta ọzọ "okara-echekwara oyiri yinye", na ọhụrụ a yinye dị ọzọ Bụrụ template maka ọzọ okirikiri.Ọ na-ewe 2-4min iji mezue loop ahụ, enwere ike ịbawanye mkpụrụ ndụ ihe ezubere iche ọtụtụ nde ugboro n'ime awa 2-3.

ỌkọlọtọPCRSistemụ mmeghachi omume

Ihe ise nke mmeghachi omume PCR

Enwere ụdị ihe dị iche iche nke ise na-etinye aka na mmeghachi omume PCR, ya bụ primer, enzyme, dNTP, template na buffer (a chọrọ Mg2+).[usoro PCR]

A na-ekewa usoro PCR ọkọlọtọ na usoro atọ

1. DNA degeneration (90 ° C-96 ° C): Ụdị DNA abụọ-agbụ n'okpuru ọrụ okpomọkụ, njikọ hydrogen na-agbaji, na-eme DNA nke otu agbụ.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Usoro okpomọkụ na-ebelata, primer na-ejikọta ya na DNA template iji mepụta mpaghara abụọ-agbụ.

3. Mgbatị (70 ℃ -75 ℃): N'okpuru omume nke Taq enzyme (ihe dị ka 72 Celsius C, ọrụ kachasị mma), a na-eji dNTP mee ihe dị ka ihe eji eme ihe, gbasaa site na njedebe 5' nke primer → 3' njedebe, njikọ na template na-akwado ibe DNA.

A na-agbaji okirikiri nke ọ bụla, gbatịa ma gbatịa, na-eme ka ọdịnaya DNA dị okpukpu abụọ.Ka ọ dị ugbu a, n'ihi mpaghara mmụba dị mkpirikpi, ụfọdụ PCR nwere ike ịmegharị ya n'ime obere oge ọ bụrụgodị na ọrụ Taq enzyme adịghị mma, ya mere enwere ike gbanwee ya na nzọụkwụ abụọ, ya bụ, annealing na mgbatị nwere ike ime na 60 ° C-65 ° C n'otu oge.Iji belata usoro ibuli elu na ịdị jụụ ma melite ọsọ nzaghachi.

Atụmatụ mmeghachi omume PCR

● Ọpụrụiche dị elu

Ihe ndị dị mkpa akọwapụtara nke nzaghachi PCR bụ: ① Ngwakọta nke primer na DNA template.② Ụkpụrụ nke njikọta isi.③ Iguzosi ike n'ihe nke mmeghachi omume njikọ TaqDNA polymerase.④ Nkọwapụta na nchekwa nchekwa nke mkpụrụ ndụ ebumnuche.

Ngwakọta ziri ezi nke primers na ndebiri bụ isi ihe.Njikọ nke primer na template na ndọtị nke agbụ primer na-adabere n'ụkpụrụ nke alkaline base dank.Iguzosi ike n'ihe nke mmeghachi omume polymerase na oke okpomọkụ nke Taq DNA polymerase iji mee ka njikọ (mkpokọta) nke template na primer na mmeghachi omume nwere ike ime na okpomọkụ dị elu.Nkọwapụta nke nchikota na-abawanye nke ukwuu.Mpempe akwụkwọ ahụ nwere ike idowe ogo dị elu nke izi ezi.Site n'ịhọrọ mpaghara mkpụrụ ndụ ihe nketa nke nwere oke nchekwa na nchekwa dị elu, nkọwa ya dị elu.

● Mmetụta dị elu

A na-abawanye olu mmepụta nke ngwaahịa PCR site na ndeksi, nke nwere ike ịgbasa template mmalite nke Picker (PG=10-12) iji mee ka ọkwa microcontroller dị elu na ọkwa micrograms (μg= -6).Enwere ike ịchọta mkpụrụ ndụ e lekwasịrị anya site na otu nde sel;na nchọpụta nke nje, uche nke PCR nwere ike iru 3 RFU (ntụpọ efu kpụrụ nkeji);Opekempe achọpụtara na sayensị nje bụ nje bacteria 3.

● Dị Mfe na Ọsọ

Ntụle PCR na-eji Taq DNA polymerase dị elu, nke na-agbakwụnye ngwọta mmeghachi omume n'otu oge, ya bụ, mmeghachi omume degeneration-anneal-extension na ngwọta mmụba DNA na ite mmiri ịsa ahụ.N'ozuzu, mmeghachi omume mmụba na-agwụ n'ime awa 2 ruo 4.A na-enyocha ngwaahịa ndị agbakwunyere n'ozuzu site na mma agha eletrik, na enweghịkwa iji isotopes, enweghị mmetọ redioaktivu, yana nkwalite dị mfe.

● Ịdị ọcha nke ihe nlele ahụ dị ala

Ọ dịghị mkpa ikewapụ nje ma ọ bụ nje bacteria na sel omenala.Enwere ike iji ngwaahịa crude DNA na RNA mee ihe dị ka amplifiers.Enwere ike iji nchọpụta mmụba DNA mee ihe ozugbo site na iji ụdị ụlọ ọgwụ dịka ọbara, mmiri mmiri ahụ, mmiri ịsa ụkwara, ntutu isi, mkpụrụ ndụ, na anụ ahụ dị ndụ.

PCRnsogbu nkịtị

● Ụgha na-adịghị mma, enweghị eriri agbapụta

Akụkụ bụ isi nke mmeghachi omume PCR gụnyere: ① nkwadebe template nucleic acid, ② àgwà na nkọwa nke primers, ③ àgwà enzymes ④ ọnọdụ okirikiri PCR.Ịchọta ihe kpatara ya kwesịkwara inyocha ma mụọ maka njikọ ndị a dị n'elu.

Templates: ① Nhazi ahụ nwere protein dị iche iche, ② Ihe ndebiri nwere ihe mgbochi enzyme Taq, ③ A naghị ewepụ protein dị na template, ọkachasị protein otu dị na chromosome.⑤ Deminer nucleic acid degeneration adịghị nke ọma.Mgbe ịdị mma nke enzymes na primers dị mma, ọ dịghị ihe nrịbawanye mma, nke kachasị bụrụ ọgwụgwọ mgbaze nke ụdị.Enwere ihe na-adịghị mma na template nucleic acid usoro mmịpụta, ya mere, iji kwadebe ihe ngwọta mgbaze dị irè ma kwụsie ike, usoro ya kwesịrị idozi ma ghara ịgbanwe ya n'ụzọ na-ezighị ezi.

Enzyme inactivation: a ga-ejikọ enzyme ọhụrụ ma ọ bụ nke ochie na nke ọhụrụ iji nyochaa ma ọrụ enzyme ahụ efunahụla ma ọ bụ ezughi oke, na-eduga na adịghị mma.Ekwesiri ighota na a na-echefu Taq enzyme ma obu ethidium bromide mgbe ufodu.

Primer: àgwà nke primer, ntinye uche nke primer, na ma ntinye nke primers abụọ ọ bụ symmetrical.Ọ bụ ihe na-emekarị maka ọdịda PCR ma ọ bụ ìgwè na-arịwanye elu adịghị mma ma nwee ike ịgbasa.Enwere nsogbu na ogo nke primers nke ọnụọgụ ọnụọgụ ụfọdụ.Abụọ primers nwere nnukwu ntinye uche na ntinye dị ala, na-eme ka mmụba asymmetric dị ala.Usoro mgbochi bụ: ① Họrọ ezigbo primer iji megharịa nkeji.② Ntinye uche nke primer ọ bụghị naanị na-adabere na uru OD, kamakwa ọ na-eleba anya na mmiri mmiri mbụ nke primer na-eme ka agar sugar gel electrophoresis.A ghaghị inwe mpaghara warara primer, na nchapụta nke primers abụọ kwesịrị ịdị na-agbanwe agbanwe.Belt, PCR nwere ike daa n'oge a, ma ekwesịrị idozi ya na ngalaba njikọ primer.Ọ bụrụ na primer dị elu, nchapụta ahụ dị ala, na itinye uche ya ga-edozirịrị mgbe agbazere ya.③ Ekwesịrị ịkwụ ụgwọ ma chekwaa primer n'ọkwa dị elu iji gbochie ọtụtụ friji ma ọ bụ akụkụ refrigeration ogologo oge nke friji, nke ga-eme ka primer daa ma mebie.④ Nhazi nke primer bụ ihe ezi uche na-adịghị na ya, dị ka ogologo nke primer ezughị oke, na ụyọkọ di iche iche na-emepụta n'etiti ndị na-emepụta ihe.

Mg2 + itinye uche: Mg2 + ion itinye uche na-enwe mmetụta dị ukwuu na arụmọrụ nkwalite PCR.Nnukwu itinye uche nwere ike ibelata mmekọ nwoke na nwanyị nke PCR.Ọ bụrụ na ịta ahụhụ dị oke ala, mmepụta mmụba PCR ga-eme ka PCR amplification dara ada na-enweghị eriri mgbasawanye.

Mgbanwe nke olu mmeghachi omume: Olu a na-eji na PCR amplification bụ 20ul, 30ul, na 50ul ma ọ bụ 100uL, nnukwu olu nke ngwa maka mmụba PCR ka edobere dịka ebumnuche dị iche iche nke nyocha sayensị na nyocha ụlọ ọgwụ.Mgbe ịmechara obere mpịakọta dị ka 20ul, ọ dị mkpa iji mee ka eriri eriri mgbe ị na-eme nha, ma ọ bụghị ya ga-ada.

Ihe kpatara anụ ahụ: Mgbanwe dị oke mkpa maka mmụba PCR.Ọ bụrụ na okpomọkụ degeneration dị ala, oge mmebi ahụ dị mkpụmkpụ, ọ ga-abụ na ọ ga-eme na ụgha ụgha;Okpomọkụ na-ebelata oke ala nwere ike ime ka mmụba na-abụghị nke akọwapụtara ma belata arụmọrụ nkwalite akọwapụtara.Na-emetụta nke ukwuu nchikota nke primers na ndebiri iji belata arụmọrụ nkwalite PCR.Mgbe ụfọdụ, ọ dị mkpa iji ọkọlọtọ thermometers chọpụta mgbanwe, annealing na ogologo okpomọkụ na ndọtị ma ọ bụ mmiri-soluble cooker, nke bụ otu n'ime ihe kpatara ọdịda nke PCR.

Ụdị dị iche iche nke usoro ebumnuche: Ọ bụrụ na usoro ebumnuche ahụ emee, ngbanwe ma ọ bụ ihichapụ, ngwakọta nke prototype na ndebiri, ma ọ bụ n'ihi enweghị usoro ebumnuche, primer na template ga-atụfu usoro mmekọ, yana nkwalite PCR ya agaghị aga nke ọma.

● Echiche ụgha

Igwe njupụta PCR na-egosi na ọ dabara n'usoro usoro ebumnuche, na mgbe ụfọdụ, band ya na-adị mma karịa ma dị elu.

Nhazi Primer adịghị mma: usoro nkwuwapụta ahọpụtara na usoro nkwalite enweghị ebumnuche nwere otu, yabụ mgbe PCR na-abawanye, ngwaahịa PCR na-abawanye abụghị usoro enweghị ebumnuche.Usoro ebumnuche dị oke mkpụmkpụ ma ọ bụ primer dị mkpụmkpụ, ọ na-adịkarịkwa ka ọ dị mma.Mkpa ka emegharịa ya.

Ofefe mmetọ nke usoro ebumnuche ma ọ bụ ngwaahịa nkwalite: Enwere ihe abụọ kpatara mmetọ a: Nke mbụ, mmetọ nke genome dum ma ọ bụ akụkụ buru ibu, na-eduga n'ezi echiche ụgha.Enwere ike idozi ụdị nke ọma ụgha a site n'ụzọ ndị a: Kpachapụ anya ma dị nro mgbe ị na-arụ ọrụ iji gbochie usoro ebumnuche ịkuba n'ime egbe nlele ma ọ bụ fesa na tube centrifugal.Ewezuga enzymes na ihe ndị na-enweghị ike iguzogide oke okpomọkụ, ihe niile reagents ma ọ bụ akụrụngwa kwesịrị iji nnukwu nrụgide mebie ya.Ekwesịrị iji ọkpọkọ centrifugal na ihe atụ mee ihe n'otu oge.Mgbe ọ dị mkpa, tupu ịtinye ụdị, tube mmeghachi omume na reagent na-ekpughere ụzarị ultraviolet iji bibie acid nucleic dị ugbu a.Nke abụọ, obere iberibe na mmetọ ikuku.Iberibe ndị a dị mkpụmkpụ karịa usoro ebumnuche, mana ha nwere ụfọdụ homology.Enwere ike ijikọta ya na ibe ya.Mgbe emechara primers, ngwaahịa PCR nwere ike gbasaa, nke ga-eme ka mmepụta ihe dị mma.Enwere ike iji ya belata ma ọ bụ kpochapụ usoro PCR akwụ.

● Pụta eriri nkwalite na-abụghị nke akọwapụtara

Ndị otu ndị pụtara mgbe PCR nwechara ihe ekwekọghị na nha a na-atụ anya ya, ma ọ bụ buru ibu ma ọ bụ obere, ma ọ bụ n'otu oge ahụ, ma ọ bụ n'otu oge ahụ, ụgbụ a na-amụba amụba na nke na-abụghị nke agbakwunyere.Mpụta nke eriri ndị na-abụghị nke a kapịrị ọnụ bụ: Nke mbụ, primers ezughị oke na usoro ebumnuche, ma ọ bụ polymerization nke primer iji mepụta ụyọkọ.Nke abụọ bụ na ntinye nke MG2 + ions dị oke elu, okpomọkụ na-ekpo ọkụ dị oke ala, yana ọnụ ọgụgụ nke PCR cycles metụtara.Nke abuo, àgwà na ego nke enzymes.Ọtụtụ mgbe, enzymes nke ụfọdụ isi mmalite na-adịkarị mfe maka eriri ndị na-abụghị ndị pụrụ iche na enzymes nke ebe ọzọ adịghị eme.Mgbe ụfọdụ mmụba nke enzymes na-abụghị nke akọwapụtara na-emekwa.Ihe ndị a na-emeghachi omume bụ: ihe na-adọrọ adọrọ ma ọ bụrụ na ọ dị mkpa.Belata ọnụọgụ nke enzyme ma ọ bụ dochie enzyme nke isi iyi ọzọ.Belata ego nke isi, bulie ọnụọgụ ndebiri nke ọma, wee belata ọnụọgụ okirikiri.Mee ka ọ dịkwuo ọkụ nke ọma ma ọ bụ jiri usoro ebe okpomọkụ abụọ (93 ° C degeneration, annealing na ịgbatị ihe dịka 65 ° C).

● Na-egosi ihe ndọkụrịta na-adịghị mma ma ọ bụ teepu smear

Nkwalite PCR mgbe ụfọdụ na-egosi ka etinyere ya ma ọ bụ kpụọ ya ma ọ bụ kapet dị ka eriri.N'ihi ya, n'ihi oke nke enzymes ma ọ bụ adịghị mma nke enzymes, ntinye dNTP dị oke elu, ntinye Mg2+ dị oke elu, okpomọkụ na-ekpo ọkụ dị ntakịrị, ọnụ ọgụgụ nke okirikiri dị ukwuu.Ihe mgbochi ndị a bụ: ①Welata ọnụ ọgụgụ nke enzymes, ma ọ bụ gbanwee enzyme nke isi iyi ọzọ.②Welata mkpokọta dNTP ③Wedata nke ọma Mg2+ itinye uche.④ Mee ka ọnụọgụ ndebiri wee belata ọnụọgụ okirikiri.

Ngwaahịa ndị emetụtara

PCR Hero (Ya na Dye)

◮ Ikwesị ntụkwasị obi dị elu: 6 ugboro nke enzyme Taq nkịtị;

◮ Ọsọ nkwalite ngwa ngwa

◮ Mgbanwe nke ndebiri ọzọ

◮ Ịrụ ọrụ nkwalite dị elu

◮ Nnagide gburugburu ebe obibi siri ike: etinye ya na 37 Celsius maka otu izu, na-ejigide ihe karịrị 90% ọrụ;

◮ Ọ nwere 5'→3' DNA polymerase ọrụ na 5'→3' exonuclease ọrụ, na-enweghị 3'→5' exonuclease ọrụ.

PCR Easyᵀᴹ (Ya na Dye)

Usoro mmeghachi omume pụrụ iche na arụmọrụ Taq DNA Polymerase dị elu na-eme ka mmeghachi omume PCR nwee nrụpụta nkwalite dị elu, nkọwapụta na nghọta.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Otu Nzọụkwụ) -SYBR Green I

Ngwa otu nzọụkwụ na-eme ntụgharị ntụgharị na qPCR mmeghachi omume abụọ n'otu tube, naanị ịkwesịrị ịgbakwunye RNA template, kpọmkwem PCR primers na RNase-Free ddH.₂O.

◮ Ngwa ahụ nwere ike nyochaa ngwa ngwa RNA viral ma ọ bụ trace RNA.

◮ Ngwa ahụ na-eji ihe ntụgharị ntụgharị pụrụ iche nke Foregene na Foregene HotStar Taq DNA Polymerase jikọtara ya na sistemu mmeghachi omume pụrụ iche iji melite arụmọrụ nkwalite na nkọwapụta mmeghachi omume ahụ nke ọma.

◮ Usoro mmeghachi omume kachasị mma na-eme ka mmeghachi omume ahụ nwee mmetụta nchọpụta dị elu, nkwụsi ike okpomọkụ siri ike, na ndidi ka mma.

◮ RT-qPCR dị mfe^TM(Otu Nzọụkwụ) -SYBR Green I kit na-abịa na ROX n'ime ntụ ntụ ntụ, nke enwere ike iji wepụ ihe mgbaàmà na njehie mgbaàmà n'etiti olulu mmiri, nke dị mma maka ndị ahịa iji na ụdị dị iche iche nke akụrụngwa PCR.

RT Mfe^TMII (Master Premix maka njikọ cDNA nke mbụ makaReal Time PCR)

-Ike dị mma iwepu gDNA, nke nwere ike wepu gDNA na ndebiri n'ime nkeji 2.

Sistemụ ntụgharị ntụgharị nke ọma, ọ na-ewe naanị nkeji iri na ise iji mechaa njikọ nke eriri cDNA mbụ.

-Edebere mgbagwoju anya: ndebiri nwere ọdịnaya GC dị elu yana usoro nke abụọ dị mgbagwoju anya nwekwara ike iji ọrụ dị elu tụgharịa.

Sistemụ ntụgharị ntụgharị uche dị elu, ndebiri pg nwere ike nweta cDNA dị elu.

Sistemụ ntụgharị ntụgharị nwere nkwụsi ike dị elu, ezigbo mmeghachi omume okpomọkụ bụ 42 ℃, ọ ka nwere arụmọrụ ntụgharị ntụgharị dị mma na 50 ℃.