Nnwale RT-qPCR gụnyere mmịpụta RNA na nyocha ịdị mma, ntụgharị ntụgharị na qPCR nzọụkwụ atọ, usoro nke ọ bụla nwere ọtụtụ ịkpachara anya, anyị ga-ewebata n'ụzọ zuru ezu n'okpuru.

ⅠNtụle ogo RNA

N'ime nnwale RT-qPCR, ka emechara mmịpụta RNA, ọ dị mkpa ka enyocha ogo RNA, yana nnwale na-esochi nwere ike ịme naanị mgbe ọ tozuru oke.Ụzọ nyocha gụnyere spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 analysis, nke a na-ejikarị spectrophotometer na agarose gel electrophoresis nchọpụta usoro.Ekwesiri ighota na uzo abuo ndia kwesiri ka ejikota onu iji mezue nchoputa na nyocha nke itinye uche RNA, idi ocha na iguzosi ike n'ezi ihe, iji hụ na RNA di nma.

Ngwa iche iche RNA metụtara: 

Ngwakọta mkpokọta cell RNA iche

Enwere ike nweta mkpokọta RNA sachachara nke ọma na nke dị elu site na mkpụrụ ndụ emebere dị iche iche n'ime nkeji iri na otu.

Ngwakọta Mkpokọta RNA anụmanụ

Ngwa ngwa na ịrụ ọrụ nke ọma wepụta mkpokọta RNA ịdị ọcha na ịdị elu dị elu site na anụ ahụ anụmanụ dị iche iche.

Spectrophotometer:

A na-ejikarị spectrophotometer iji chọpụta ntinye na ịdị ọcha nke RNA, mana ọ nweghị ike ịchọpụta iguzosi ike n'ezi ihe nke RNA na ihe fọdụrụ na genomic.N'ime ha, A260/280 na A260/230 bụ ihe dị mkpa maka nchọpụta ịdị ọcha RNA, enwere ike ịchọpụta ịdị ọcha RNA dịka mgbanwe nke ụkpụrụ ha si dị:

1. 1.9 2.1, na-egosi mmebi nke RNA nwere ike ime, nke a ga-enwetakwu nkwenye site na agarose gel electrophoresis.

2. 2.0

Agarose gel electrophoresis:

Agarose gel electrophoresis assay nwere ike nyochaa iguzosi ike n'ezi ihe RNA, genome na foduru protein, mana enweghị ike ịkọwapụta mkpokọta RNA n'ụzọ ziri ezi ma ọ bụ chọpụta ihe fọdụrụ nke reagents organic.Were ndebiri RNA eukaryotic dịka ọmụmaatụ:

1. A na-edozi RNA na agarose gel electrophoresis.Ọ bụrụ na enwere naanị otu eriri atọ nke 28sRNA, 18sRNA na 5.8sRNA na maapụ gel, ọ na-egosi na RNA ewepụtara adịghị.Ọ bụrụ na enwere ihe na-adọkpụ, ọ na-egosi mmebi akụkụ nke RNA.

2. Ọ bụrụ na enwere otu eriri na-egbuke egbuke n'etiti oghere gluu na band 28sRNA, enwere ike ịnwe ihe fọdụrụnụ DNA nke genomic.

3. Ọ bụrụ na eriri na-apụta na oghere gluu, ọ na-egosi na enwere ike ịnwe ihe fọdụrụ nke protein na ihe ndị ọzọ macromolecular.

Ⅱ. Ntugharị azụ azụ

Ka emechara mmịpụta RNA, ọ dị mkpa ka atụgharịghachi ya na cDNA maka nnwale ndị na-esote, yabụ nzọụkwụ ngbanwe dị mkpa.A ga-ewebata ntụgharị ntụgharị site na nhọrọ nke reverse transcriptase na primer:

Weghachite nhọrọ ntụgharị ederede:

Ụdị transcriptase a na-ahụkarị gụnyere AMV RTase na MMLV RTase.RNase H nke AMV RTase nwere ọrụ siri ike, ogologo njikọ ogologo oge, ọnụ ọgụgụ dị ala na nkwụsi ike dị mma (42 ~ 55 ℃).Ọrụ RNase H nke MMLV RTase adịghị ike, ogologo njikọ ahụ dị ogologo, ọnụọgụ njikọ dị elu, na nkwụsi ike nke okpomọkụ adịghị mma (37 ~ 42 ℃).

N'ihi na enzyme RNase H nwere ọrụ nke ndebiri RNA na-eweda ala, MMLV nwere ọrụ RNase H na-adịghị ike kwesịrị ka ahọpụtara nke ọma n'oge ntụgharị ntụgharị, ma emesịa injinia mkpụrụ ndụ ihe nketa, nkwụsi ike okpomọkụ nke MMLV erutela nrịgo mma.Na-ewere ForegeneTranscriptase ntụgharị ihu (M-MLV maka ntụgharị ntụgharị) dị ka ọmụmaatụ, ọ bụ ọhụrụ reverse transcriptase nke e gosipụtara na nje bacteria E. coli engineered site na iji nkà na ụzụ recombination genetic.Ọ bụ polymerase DNA recombinant nke na-emepụta eriri DNA na-akwado ya site na RNA, DNA, ma ọ bụ RNA: DNA ngwakọ.Ọ nweghị ọrụ RNase H, nkwụsi ike siri ike, njikọ RNA siri ike, yana nghọta dị elu.

 

Transcriptase ntụgharị ihu (M-MLV maka ntụgharị ntụgharị)

Nhọrọ nke primer:

N'ozuzu, RT primers na-adaba n'ụdị atọ: oligo dT, primers random, na gene-kpọmkwem primers.Họrọ primers kwesịrị ekwesị maka ojiji dịka ihe nyocha dị iche iche siri dị.

1. Ọ bụrụ na template bụ nke eukaryotic sitere na njedebe cDNA na-eji maka nkwalite PCR na-aga n'ihu, a na-atụ aro Oligo (dT);Ọ bụrụ na a na-eji nnwale na-esote naanị maka qPCR, a na-atụ aro ka agwakọta Oligo (dT) na primers na-enweghị usoro iji melite arụmọrụ nke ntụgharị ntụgharị.

2. Ọ bụrụ na ndebiri sitere na prokaryotes, Random Primers ma ọ bụ mkpụrụ ndụ ihe nketa kpọmkwem kwesịrị ịhọrọ maka ntụgharị ntụgharị.

Ⅲ.qPCR

A na-akọwapụta ọkwa fluorescence nke ọma site na nhọrọ nke ụzọ ọnụọgụ, ụkpụrụ nhazi nke mbụ, nhọrọ ROX, nhazi usoro mmeghachi omume na ọnọdụ mmeghachi omume, wdg.

Nhọrọ nke ụzọ ọnụọgụ:

A na-ekewa usoro ọnụọgụ n'ime usoro ọnụọgụ nke ikwu na usoro ọnụọgụ zuru oke.Enwere ike iji ọnụọgụ dị iche iche chọpụta mmetụta nke usoro ọgwụgwọ ụfọdụ na okwu mkpụrụ ndụ ihe nketa, chọpụta ọdịiche nke mkpụrụ ndụ ihe nketa n'oge dị iche iche ma tụnyere ọdịiche nke mkpụrụ ndụ ihe nketa na anụ ahụ dị iche iche.Nkọwa zuru oke nwere ike ịchọpụta ọnụọgụ nucleic acid dị na nje na ihe ndị ọzọ.Mgbe anyị na-eme nnwale, anyị ga-ahọrọ usoro ọnụọgụ kwesịrị ekwesị dịka nnwale nke anyị siri dị.

Ụkpụrụ nhazi mbụ:

Nhazi nke primer maka qPCR nwere njikọ chiri anya na nrụpụta nkwalite yana nkọwa ngwaahịa.Ya mere, ịmepụta ezigbo primers bụ nzọụkwụ mbụ nke qPCR na-aga nke ọma.N'ime nhazi nke primer, a ga-aṅa ntị na ụkpụrụ ndị a mgbe ị na-ezute ụkpụrụ nke nhazi nke mbụ:

1. A na-achịkwa ogologo nke mpempe ihe mgbaru ọsọ n'etiti 100 na 300 bp;

2. Cross-exon imewe iji zere mmetụta nke DNA genomic;

3. Ọ dị mkpa ka a nwalee primers ndị a haziri maka ịrụ ọrụ nke ọma, na naanị mgbe nrụpụta nkwalite ruru ọkọlọtọ (90-110%) nwere ike iji ha mee ihe maka nyocha ọnụọgụ;

4. A na-emekarị ntinye uche nke mbụ n'etiti 0.1uM na 1.0uM.

Nhọrọ nkeROX:

N'ime usoro mmeghachi omume quantitative, ROX nwere ike ịhazigharị ọdịiche ụzọ anya anya, njehie pipetting ma ọ bụ ọdịiche olu kpatara site na evaporation na condensation n'otu n'otu, na-emeziwanye nsonaazụ nsonaazụ.Agbanyeghị, ekwesịrị ịmara na nhọrọ nke ROX metụtara ngwa ahụ.Ọ bụrụ na ngwá ọrụ qPCR nwere ọrụ nke na-edozi ihe dị iche n'etiti oghere, ọ dịghị mkpa ịgbakwunye ROX;ma ọ bụghị ya, ọ kwesịrị ịgbakwunye ROX mgbazi.Obere ndị mmekọ na ịzụrụ reagents ga-adịrịrị ka ngwa eji ahọrọ ROX ziri ezi, zere mmejọ emechaa.

Nkwadebe nke usoro mmeghachi omume:

A na-ahọrọ mpịakọta mmeghachi omume nke 20ul na 50ul.Ekwesịrị ilebara ihe ndị a anya mgbe emebere sistemụ ahụ:

1. Ekwesịrị ịkwadebe usoro mmeghachi omume site na ikuku ventilashị na bench na-arụ ọrụ dị ọcha, ddH ọhụrụ.₂A na-eji O maka nnwale ọ bụla;

2. Onye ọ bụla nnwale kwesịrị ịkwadebe NTC iji nyochaa ma e nwere mmetọ na usoro, na ọ bụla ụzọ primers kwesịrị ime NTC mgbe na-akwadebe usoro;

3. Iji chọpụta ma ọ dị ihe fọdụrụ gDNA na template RNA, NRT nwere ike ịkwado maka nlele ọ bụla maka nchọpụta;

4. Mgbe ị na-akwadebe usoro ahụ, a na-atụ aro ka ịme ma ọ dịkarịa ala 3 teknụzụ ugboro ugboro maka otu ihe atụ;

5. Mgbe ndebiri bụ cDNA, a na-atụ aro ka ịgbanye oge 5-10 iji belata mmetụta mgbochi nke usoro ntụgharị ntụgharị na nnwale qPCR.Ọ ka mma inyocha ọnụọgụ ndebiri site na gradient, nke mere na uru CT dabara n'etiti 20-30;

6. Kpebie ọnụ ọgụgụ mmeghachi omume achọrọ, mụbaa site na 5-10% na ndabere nke ọnụ ọgụgụ mmeghachi omume, ma gbakọọ ọnụ ọgụgụ nhazi olu;

7, a na-akwado usoro ahụ site na iji ụkpụrụ premix, na-agwakọta mgbe centrifugation ma hụ na ọ dịghị egosipụta;

8, Dị ka o kwere mee ịhọrọ ihe ndị na-akwado ihe oriri.

Ngwa RT-qPCR emetụtara