Mgbochi nke ndụmọdụ pipette na EP tubes, wdg.
1. Kwadebe 0.1% (otu puku) DEPC (ihe na-egbu egbu nke ukwuu) na mmiri deionized, jiri nlezianya mee ya na mkpuchi uzuzu, ma chekwaa ya na 4 ° C pụọ na ìhè;
Mmiri DEPC bụ mmiri dị ọcha nke DEPC na-agwọ ya ma mee ka ọ dị elu site na nnukwu okpomọkụ na nrụgide dị elu.A nwalere ka enweghị RNase, DNA na proteinase.
2. Tinye ọnụ ọnụ pipette na EP tube n'ime 0.1% DEPC, ma hụ na ọnụ ọgụgụ pipette na EP tube jupụtara na 0.1% DEP.
3. Chebe site na ìhè, ka guzoro, abalị (12-24h)
4. Igbe nke nwere ọnụ na EP tube adịghị mkpa ka etinye ya na DEPC.Mgbe ewepụchara mmiri DEPC n'ọnụ ma ọ bụ tube EP, bukọta ya ma kechie ya.
5. 121 Celsius, 30 min
6. 180 Celsius, nkụ ruo ọtụtụ awa (opekata mpe 3 awa)
Mara: a.Yiri uwe mkpuchi latex na ihe mkpuchi mgbe ị na-ejikwa DEPC!b, ma ọ bụ na-enweghị DEPC sterilization, 130 ℃, 90min autoclave (ọtụtụ laboratories elu okpomọkụ igba ogwu ugboro abụọ)
Atụmatụ mmịpụta RNA
Ihe ngosi abụọ bụ isi nke ọdịda ikewapụ RNA anụ ahụ
mmebi nke RNA na ihe ndị na-adịghị ọcha na anụ ahụ,gbasara mmebi iwu, ka anyị buru ụzọ leba anya n'ihe kpatara na RNA nke ewepụtara na mkpụrụ ndụ emebere anaghị adị mfe eweda ya ala.Reagents mmịpụta RNA dị adị nwere ihe niile na-egbochi RNase ngwa ngwa.Tinye lysate na mkpụrụ ndụ ndị a na-eme omenala, ma gwakọta ya naanị, a ga-ejikọta mkpụrụ ndụ niile na lysate, na mkpụrụ ndụ ahụ na-ekpochapụ kpamkpam.Mgbe sel ndị ahụ gbasasịrị, ihe ndị na-arụ ọrụ na lysate na-egbochi intracellular RNase ozugbo, ya mere RNA na-anọgide na-adịghị.Nke ahụ bụ, n'ihi na mkpụrụ ndụ ndị a na-emepụta na-adị mfe ma na-ejikọta ya na lysate, RNA ha anaghị adị mfe iweda ya;N'aka nke ọzọ, RNA dị na anụ ahụ na-adị ngwa ngwa n'ihi na sel ndị dị na anụ ahụ adịghị mfe ịkpọtụrụ lysate ngwa ngwa.n'ihi kọntaktị zuru oke.Yabụ,na-eche na e nwere ụzọ isi gbanwee anụ ahụ ka ọ bụrụ otu cell mgbe ọ na-egbochi ọrụ RNA, nsogbu nke mbibi nwere ike dozie kpamkpam.
Ngwunye nitrogen mmiri mmiri bụ ụzọ dị otú ahụ kachasị dị irè.Otú ọ dị, usoro egwe ọka nitrogen mmiri mmiri na-enye nsogbu, karịsịa ma ọ bụrụ na ọnụ ọgụgụ nke samples buru ibu.Nke a mere ka ihe kacha mma pụta: homogenizer.NkehomogenizerUsoro anaghị atụle ajụjụ banyere otu esi egbochi ọrụ RNase tupu a na-akpọtụrụ sel na lysate, kama ọ na-ekpe ekpere ka ọnụego nke mmebi anụ ahụ dị ngwa ngwa karịa ọnụego nke intracellular RNase na-eweda RN.
Mmetụta nke homogenizer eletriki dị mma,na mmetụta nke iko homogenizer adịghị mma, ma n'ozuzu, usoro homogenizer enweghị ike igbochi ihe mmebi ahụ.Ya mere, ọ bụrụ na mmịpụta ahụ mebiri emebi, a ga-eji homogenizer eletrik mbụ mee ihe maka igwu mmiri na nitrogen mmiri;The mbụ iko homogenizer kwesịrị ịgbanwe ka ihe electric homogenizer ma ọ bụ na-egweri na mmiri mmiri nitrogen.Nsogbu a fọrọ nke nta ka ọ bụrụ 100% ga-ekwe omume.dozie.
Nsogbu fọdụrụ adịghị ọcha na-emetụta nnwale ndị na-esote nwere ihe dịgasị iche iche karịa mmebi, na ngwọta ya dịkwa iche iche.Na ngwụcha,Ọ bụrụ na enwere mmebi ma ọ bụ ihe ndị fọdụrụ na anụ ahụ, a ga-emeziwanye usoro mmịpụta / reagent maka ihe nnwale ahụ akọwapụtara.Ịkwesighi iji ihe nlele gị dị oke ọnụ ahịa maka njikarịcha: ị nwere ike ịzụta ụfọdụ ụmụ anụmanụ dị ka azụ / ọkụkọ si n'ahịa, were akụkụ kwekọrọ nke ihe maka mmịpụta RNA, na akụkụ nke ọzọ maka mmịpụta protein - jiri ọnụ, afọ na eriri afọ wepụ.
A na-eji RNA e lekwasịrị anya nke RNA ewepụtara maka nnwale nleba anya dị iche iche, ihe chọrọ ịdị mma ya dị iche
Owuwu ọba akwụkwọ cDNA chọrọ iguzosi ike n'ezi ihe RNA na-enweghị ihe ndị na-egbochi mmeghachi omume enzyme;Northern chọrọ iguzosi ike n'ezi ihe RNA dị elu yana ihe dị ala maka ihe ndị na-egbochi mmeghachi omume enzyme;RT-PCR anaghị achọ iguzosi ike n'ezi ihe RNA dị elu,ma na-egbochi mmeghachi omume enzyme.Ihe ndị fọdụrụ chọrọ siri ike.Ntinye ahụ na-ekpebi mmepụta;oge ọ bụla ebumnuche bụ inweta RNA ịdị ọcha kachasị elu, ọ ga-efu ndị mmadụ na ego.
Mkpokọta/Nchekwa nke Sample
Ihe na-emetụta mmebi ahụ Mgbe ihe nlele ahụ hapụrụ ahụ dị ndụ / ma ọ bụ gburugburu ebe uto mbụ, enzymes endogenous dị na nlele ahụ ga-amalite imebi RNA,na ọnụ ọgụgụ mmebi ahụ metụtara ọdịnaya nke enzymes endogenous na okpomọkụ.Na omenala, enwere naanị ụzọ abụọ iji gbochie ọrụ enzyme endogenous: tinye lysate ozugbo na homogenize nke ọma na ngwa ngwa;bee n'ime obere iberibe ma ozugbo ifriizi na mmiri mmiri nitrogen.Ụzọ abụọ a chọrọ ọrụ ngwa ngwa.Nke ikpeazụ kwesịrị ekwesị maka ihe nlele niile, ebe nke mbụ bụ naanị maka anụ ahụ nwere ọdịnaya dị ala nke mkpụrụ ndụ na enzymes endogenous ma dị mfe ịmekọrịta.Kpọmkwem, anụ ahụ osisi, imeju, thymus, pancreas, splin, ụbụrụ, abụba, anụ ahụ anụ ahụ, wdg na-kachasị mma na nitrogen mmiri mmiri kpọnwụrụ akpọnwụ tupu ha aga n'ihu.
Nkewa na homogenization nke samples
Ihe ndị na-emetụta mbibi na nlere anya nkewa bụmaka nke ọma homogenization, nke bụ maka ntọhapụ zuru oke na zuru oke nke RNA.Selụ nwere ike ịbụ kpọmkwem homogenized na-enweghị agbajikwa.Tissues nwere ike homogenized naanị mgbe agbajichara.Ekwesịrị imebi yist na nje bacteria na enzymes kwekọrọ tupu ha enwee ike imekọ ihe.Tissues na ala endogenous enzyme ọdịnaya na mfe homogenization nwere ike anuahade na homogenized n'otu oge na lysate site a homogenizer;anụ ahụ osisi, imeju, thymus, pancreas, splin, ụbụrụ, abụba, muscle anụ ahụ na ndị ọzọ samples, Ha nwere ma elu na endogenous enzymes ma ọ bụ na-adịghị mfe homogenized,n'ihi ya, a ghaghị ime mmebi anụ ahụ na homogenization iche iche.Ụzọ kacha bụrụ nke a pụrụ ịdabere na ya ma na-arụpụta nke ọma bụ iji mmiri mmiri na-egweri mmiri, na usoro a pụrụ ịdabere na ya nke homogenization bụ iji ọkụ homogenizer.Ihe ndetu pụrụ iche gbasara egwe ọka na mmiri mmiri nitrogen: ihe nlele agaghị agbaze n'oge usoro igwe nri niile, n'ihi na enzymes endogenous nwere ike ịrụ ọrụ mgbe oyi kpọnwụrụ.
Nhọrọ nke lysate
Na-emetụta ịdị mma nke ọrụ yana ihe ndị fọdụrụ na-adịghị ọcha endogenous ihe ngwọta lysis a na-ejikarị eme ihe nwere ike ọ fọrọ nke nta ka ọ kwụsị ọrụ RNase.Ya mere, isi ihe dị mkpa nke ịhọrọ ngwọta lysis bụ iji tụlee ya na usoro nchacha.Enwere otu ewepụrụ:A na-atụ aro ka ị jiri lysate nwere phenol mee ihe n'omume nwere nnukwu ọdịnaya enzyme endogenous ka ọ na-abawanye ikike ime ka enzymes endogenous rụọ ọrụ.
Nhọrọ nke usoro nchacha
Ihe ndị na-emetụta adịghị ọcha endogenous fọdụrụnụ, ọsọ mmịpụta Maka ihe nlele dị ọcha dịka mkpụrụ ndụ, enwere ike nweta nsonaazụ na-eju afọ na ihe fọrọ nke nta ka ọ bụrụ usoro ọ bụla dị ọcha.Mana maka ọtụtụ ihe atụ ndị ọzọ, ọkachasị ndị nwere oke adịghị ọcha dị ka osisi, imeju, nje bacteria, wdg, ịhọrọ usoro nchacha kwesịrị ekwesị dị oke mkpa.Usoro nchacha centrifugal kọlụm nwere ọsọ mmịpụta ngwa ngwa ma nwee ike wepu ihe adịghị ọcha nke na-emetụta mmeghachi omume enzymatic nke RNA na-esote, mana ọ dị oke ọnụ (Foregene nwere ike ịnye ngwa dị ọnụ ahịa, pịa nkọwa ndị ọzọ.Ebe a);iji ụzọ nchacha akụ na ụba na nke kpochapụwo, dị ka mmiri ozuzo LiCl, nwekwara ike nweta nsonaazụ na-eju afọ, mana oge ọrụ na-adị ogologo..
"Ọzụzụ atọ na nlebara anya asatọ" maka mmịpụta RNA
Ịdọ aka ná ntị 1:Kwụsị mmetọ nke enzymes exogenous.
Rịba ama 1:Yiri ihe mkpuchi na uwe aka.
Rịba ama 2:Ekwesịrị ikpochapụ tubes centrifuge, isi ndụmọdụ, mkpanaka pipette, tankị electrophoresis, na bench nnwale ndị etinyere na nnwale ahụ nke ọma.
Rịba ama 3:Ihe reagents/ihe ngwọta etinyere na nnwale ahụ, ọkachasị mmiri, ga-abụrịrị RNase n'efu.
Ịdọ aka ná ntị 2:Gbochie ọrụ nke enzymes endogenous
Rịba ama 4:Họrọ usoro homogenization kwesịrị ekwesị.
Rịba ama 5:Họrọ lysate kwesịrị ekwesị.
Rịba ama 6:Jikwaa mmalite mmalite nke nlele ahụ.
Ịdọ aka ná ntị nke atọ:Kọwaa ebumnuche mmịpụta gị
Rịba ama 7:Na usoro lysate ọ bụla na-abịaru nso na mmalite mmalite nke nlele, ọnụ ọgụgụ nke mmịpụta na-agbada nke ọma.
Rịba ama 8:Naanị akara akụ na ụba maka mmịpụta RNA na-aga nke ọma bụ ịga nke ọma na nnwale ndị na-esote, ọ bụghị mkpụrụ.
Isi mmalite iri kachasị nke mmetọ RNase
1. Mkpịsị aka bụ isi mmalite nke enzymes exogenous, ya mere a ga-eyiri uwe aka ma dochie ya ugboro ugboro.Na mgbakwunye, a ga-eyikwa ihe mkpuchi, n'ihi na iku ume bụkwa isi iyi nke enzymes.Uru ọzọ nke iyi mkpuchi mkpuchi aka bụ ichekwa onye nyocha.
2. Atụmatụ pipette, tubes centrifuge, pipettes - RNase enweghị ike ịmegharị ya site na ịmịnye nwa naanị, ya mere a ga-eji ndụmọdụ pipette na tubes centrifuge na-emeso ya na DEPC, ọ bụrụgodị na a na-ede ha dị ka DEPC.Ọ kachasị mma iji pipette pụrụ iche, hichaa ya na 75% mmanya mmanya mmanya tupu ejiri ya, karịsịa mkpanaka;na mgbakwunye, jide n'aka na ị gaghị eji ihe mkpuchi isi.
3. Mmiri/ihe nchekwa ahụ ga-enwerịrị mmetọ RNase.
4. Opekempe, a ga-ehichapụ tebụl ule na bọọlụ mmanya mmanya 75% dị ọcha.
5.Endogenous RNase niile anụ ahụ nwere endogenous enzymes, ya mere ngwa ngwa kefriza anụ ahụ na mmiri mmiri nitrogen bụ ụzọ kasị mma iji belata mmebi.Usoro nchekwa mmiri nitrogen na-egweri bụ n'ezie adịghị mma, mana ọ bụ naanị ụzọ maka anụ ahụ nwere nnukwu ọkwa nke enzymes endogenous.
6. Nlele RNA ngwaahịa mmịpụta RNA nwere ike ịnwe akara nke mmetọ RNase.
7. Plasmid mmịpụta Plasmid na-ejikarị Rnase mebie RNA, yana Rnase fọdụrụnụ kwesịrị iji Proteinase K gbarie ma PCI wepụta ya.
8. Nchekwa RNA Ọbụlagodi na echekwara ya na obere okpomọkụ, ọnụọgụ RNase ga-ebute mbibi RNA.Ihe ngwọta kachasị mma maka nchekwa ogologo oge nke RNA bụ nkwụsịtụ nnu / mmanya, n'ihi na mmanya na-egbochi ọrụ enzymatic niile na obere okpomọkụ.
9. Mgbe cations (Ca, Mg) nwere ion ndị a, ikpo ọkụ na 80C maka nkeji 5 ga-eme ka RNA na-agbaji, ya mere, ọ bụrụ na RNA dị mkpa ka a kpoo ọkụ, ihe nchekwa nchekwa ahụ kwesịrị ịnwe onye na-ahụ maka chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).
10. Enzymes ejiri mee nnwale na-esote nwere ike imerụ RNase.
Ndụmọdụ 10 maka mmịpụta RNA
1: gbochie ngwa ngwa ọrụ RNase.A na-ekpochapụ ihe nlele ngwa ngwa mgbe anakọtara, yana arụ ọrụ ngwa ngwa RNase anaghị arụ ọrụ n'oge lysis.
2: Họrọ usoro mmịpụta kwesịrị ekwesị maka anụ ahụ nwere ọdịnaya ribozyme dị elu, na anụ ahụ adipose kacha mma iji usoro nwere phenol.
3: Ogo amụma chọrọ Northern, owuwu ụlọ akwụkwọ cDNA chọrọ iguzosi ike n'ezi ihe dị elu, yana RT-PCR na RPA (nyocha nchedo Ribonuclease) anaghị achọ iguzosi ike n'ezi ihe dị elu.RT-PCR chọrọ ịdị ọcha dị elu (ihe ndị na-egbochi enzyme).
4: nke ọma homogenization bụ isi ihe na-emeziwanye mkpụrụ na ibelata mmebi.
5: Lelee iguzosi ike n'ezi ihe nke nchọpụta electrophoresis RNA, 28S: 18S = 2: 1 bụ akara zuru oke, 1: 1 na-anabatakwa maka ọtụtụ nnwale.
6: Mwepụ DNA maka RT-PCR, array analysis Ọ kacha mma iji DNA I wepụ DNA.
7: Belata mmetọ nke enzymes exogenous - enweghị ike ibubata enzymes n'èzí.
8: Mgbe itinye uche nucleic acid dị ala, a ga-agbakwunye reagent co-zoo mmiri.Mana iji gbochie co-precipitant nwere enzymes na DNA mmetọ.
9: Gbanyụọ RNA nke ọma, ọ bụrụ na ọ dị mkpa, kpoo ọkụ na 65C maka nkeji 5.
adabara usoro nchekwa
Enwere ike ịchekwa ya na -20C maka obere oge, yana na -80C ogologo oge.Nzọụkwụ mbụ iji meziwanye mkpụrụ RNA bụ ịghọta na ọdịnaya RNA nke ihe nlele dị iche iche dịgasị iche iche.Ọganihu dị elu (2-4ug/mg) dị ka imeju, pancreas, obi, ọkara (0.05-2ug/mg) dị ka ụbụrụ, embrayo, akụrụ, akpa ume, thymus, ovary, obere ụba (<0.05ug/mg) mg) dị ka eriri afo, ọkpụkpụ, abụba.
1: mkpụrụ ndụ Lyse ịhapụ RN - ọ bụrụ na ewepụtaghị RNA, mkpụrụ ga-ebelata.Eletrik homogenization na-arụ ọrụ nke ọma karịa ndị ọzọ homogenization ụzọ, ma ọ nwekwara ike mkpa ijikọ na ụzọ ndị ọzọ, dị ka mmiri mmiri nitrogen mashing, enzymatic mgbaze (Lysozyme/Lyticase)
2: Kachasị mma nke usoro mmịpụta.Nsogbu kachasị na ụzọ dabere na phenol bụ ezughị ezu stratification na mfu RNA nke akụkụ (enweghị ike iwepụ ya kpamkpam).Stratification na-ezughị ezu bụ n'ihi nnukwu nucleic acid na protein protein, nke a ga-edozi site n'ịba ụba nke lysate eji ma ọ bụ ibelata ihe nlele.Agbakwunyere nzọụkwụ nke mmịpụta chloroform na anụ ahụ adipose.Enwere ike ibelata mfu RNA site na ịgbapụta azụ ma ọ bụ wepụ oyi akwa organic na-esote centrifugation.Nsogbu kachasị na ụzọ dabere na kọlụm centrifugation bụ ngafe sample.
Ndụmọdụ Mwepụta Omuma
1. Phenol ọcha: Tinye nha nha nha nke 1: 1 phenol / Chloroform na mix ike maka 1-2 nkeji.Centrifuge na oke ọsọ maka nkeji 2.Jiri nlezianya wepụ ihe dị elu (80-90%).Abanyela oyi akwa etiti.Enwere ike itinye nha nha nha nke ngwọta mmeghachi omume na phenol/Chloroform ma wepụ ihe dị elu.Enwere ike ịgwakọta ihe dị elu abụọ ahụ ọnụ maka mmiri ozuzo nucleic acid iji meziwanye mkpụrụ.Adịla nwayọọ mgbe ị na-agwakọta, ma anwala iwepu ihe niile dị elu.
2. Na-asa ahụ na 70-80% ethanol: N'oge ịsa ahụ, a ghaghị ịkwụsịtụ nucleic acid iji hụ na a na-asachapụ nnu fọdụrụnụ.N'otu oge ahụ, ozugbo wụsa ethanol, centrifuge na oke ọsọ maka sekọnd ole na ole, wee wepụ ethanol fọdụrụnụ na pipette.Igbari mgbe guzoro na ụlọ okpomọkụ maka 5-10 nkeji.
11. Mwepụta nke òtù pụrụ iche
1. Anụ ahụ fibrous: Igodo nke mmịpụta RNA sitere na anụ ahụ fibrous dị ka akwara obi / skeletal bụ imebi anụ ahụ kpamkpam.Anụ ahụ ndị a nwere njupụta cell dị ala, yabụ ọnụọgụ RNA kwa otu ịdị arọ nke anụ ahụ dị ala, ọ kachasị mma iji ego mmalite dị ka o kwere mee.Jide n'aka na ị ga-egweri anụ ahụ nke ọma n'okpuru ọnọdụ oyi.
2. Anụ ahụ nwere nnukwu protein/abụba ọdịnaya: ụbụrụ / akwụkwọ nri ọdịnaya dị elu.Mgbe mmịpụta PCI gasịrị, supernatant nwere floccules ọcha.Ekwesịrị iji chloroform wepụtaghachi ihe dị elu.
3. Anụ ahụ nwere nnukwu nucleic acid / ribozyme ọdịnaya: splin / thymus nwere nnukwu nucleic acid na ribozyme ọdịnaya.Anụ ahụ na-egweri n'okpuru ọnọdụ oyi na-esochi ngwa ngwa homogenization nwere ike ime ka ribozymes rụọ ọrụ nke ọma.Otú ọ dị, ọ bụrụ na lysate dị oke viscous (n'ihi nnukwu ọdịnaya nucleic acid), mmịpụta PCI agaghị enwe ike ịgbatị nke ọma;ịgbakwunye lysate ọzọ nwere ike dozie okwu a.Mwepụta PCI ọtụtụ nwere ike wepu DNA fọdụrụnụ ọzọ.Ọ bụrụ na mmiri na-acha ọcha na-etolite ozugbo agbakwunyere mmanya, ọ na-egosi mmetọ DNA.Mwepụtaghachi ya na PCI acid acid mgbe mgbasa nwere ike wepu mmetọ DNA.
4. Ihe ọkụkụ: Anụ anụ ahụ dị mgbagwoju anya karịa anụ ahụ anụmanụ.N'ozuzu, a na-akụ osisi n'okpuru ọnọdụ nitrogen mmiri mmiri, ya mere mmebi nke RNA site na enzymes endogenous bụ ihe a na-adịghị ahụkebe.Ọ bụrụ na edozighị nsogbu mmebi ahụ, ọ fọrọ nke nta ka ọ bụrụ na ọ bụ adịghị ọcha dị na nlele ahụ.Ihe na-adịghị ọcha dị n'ọtụtụ osisi ga-eduga na residues, na ihe kpatara residues bụ mgbe n'ihi na ndị a adịghị ọcha nwere ụfọdụ myirịta na RNA: ị precipitate na m precipitate, na ị adsorb na m adsorb.Njirimara ndị a na-ekpebi na ha bụ ndị na-egbochi enzyme siri ike.
Ka ọ dị ugbu a, enwere ike ịmegharị reagents mmịpụta RNA azụmahịa na ihe fọrọ nke nta ka ọ bụrụ anụ ahụ anụmanụ niile nwere obere mgbanwe, mana enwere reagents mmịpụta RNA ole na ole nwere ike dabara maka ọtụtụ anụ ahụ osisi.Ọ dabara nke ọma, Foregene nwere ike inye pụrụ ichengwa mmịpụta RNA osisi, anyị nwereNgwakọta mkpokọta RNA kewapụ ihe ọkụkụ, Ngwakọta mkpokọta RNA kewapụrụ ihe ọkụkụ Plus.Emebere nke ikpeazụ maka osisi nwere nnukwu polysaccharide na polyphenol.Maka mmịpụta RNA, nzaghachi sitere n'aka ndị ọrụ ụlọ nyocha kacha mma.
12. Mmetụta nke ntu oyi na thawing Ihe nlele oyi kpọnwụrụ nwere ike ibu ibu, ọ dịkwa mkpa ka ebipụ ya tupu ejiri ya mee ihe maka mmịpụta RNA.Ihe nlele na-agbaze (ikekwe akụkụ) n'oge ịkpụ.Enwere ike tụọ ihe nlele oyi kpọnwụrụ tupu mmịpụta RNA, na agbaze ga-emerịrị n'oge usoro a.Mgbe ụfọdụ, thawing nke sample na-emekwa n'oge mmiri mmiri nitrogen-egwe ọka;ma ọ bụ oyi kpọnwụrụ sample na-agbakwunyere ozugbo na lysate na-enweghị mmiri mmiri nitrogen-egwe ọka, na thawing ga-maa eme tupu zuru ezu homogenization.Nnwale egosila na anụ ahụ jụrụ oyi na-adịkarị mfe imebi RNA n'oge agbaze karịa anụ ahụ ọhụrụ.O yikarịrị ka ihe kpatara ya: Usoro ịsa oyi na-akpaghasị ihe dị n'ime cell, na-eme ka ọ dịkwuo mfe maka enzymes endogenous ịbịa na kọntaktị RNA ozugbo.
13. Mkpebi nke àgwà RNA Na-emekarị, a na-eji electrophoresis ekpe ikpe ziri ezi nke RNA, na A260/A280 na-eji ikpe ịdị ọcha nke RNA.Na tiori, RNA na-emebibeghị nwere oke nke 28S:18S = 2.7:1, na ọtụtụ data na-emesi oke ruru 28S:18S = 2:1.Nke bụ eziokwu bụ na ọ fọrọ nke nta ka ọ bụrụ na ọ nweghị RNA ọ bụla ewepụtara na nlele ọzọ karịa mkpụrụ ndụ dị na nha 2: 1 (enwetara nke a site na iji Agilent Bioanalyzer).
A na-emetụta nsonaazụ electrophoresis nke RNA site na ọtụtụ ihe, gụnyere usoro nke abụọ, ọnọdụ electrophoresis, ibu nlele, ogo nke saturation site na EB, wdg. Jiri electrophoresis nwa amaala chọpụta RNA ma jiri DNA Marker dị ka njikwa.Ọ bụrụ na 28S na 2kb na 18S na 0.9kb doro anya, yana 28S: 18S> 1, iguzosi ike n'ezi ihe nwere ike izute ihe achọrọ nke nnwale ndị na-esote.
A260/A280 bụ ihe na-egosi nke butere ọtụtụ mgbagwoju anya.Nke mbụ, ọ dị mkpa ịkọwapụta nkọwa mbụ nke ihe ngosi a maka acid nucleic: RNA dị ọcha, A260/280 = banyere 2.0.RNA dị ọcha bụ 'ihe kpatara' yana A260/A280 = 2 bụ 'mmetụta'.Ugbu a onye ọ bụla na-eji A260/A280 dị ka 'ihe kpatara', na-eche na "ọ bụrụ na A260/A280 = 2, mgbe ahụ RNA dị ọcha", nke na-eduga ná mgbagwoju anya.
Ọ bụrụ na ị nwere mmasị, ị nwere ike itinye obere reagent nke a na-ejikarị na mmịpụta, dị ka phenol, guanidine isothiocyanate, PEG, wdg, na nlele RNA gị, wee tụọ nha A260/A280.Nke bụ eziokwu bụ na ọtụtụ n'ime reagents eji maka mmịpụta RNA, yana ọtụtụ adịghị ọcha na nlele ahụ, na-amịkọrọ gburugburu A260 na A280, na-emetụta A260/A280.
Ụzọ kacha akụzi ihe ugbu a bụ inyocha ihe nlele RNA na nso 200-300 nm.Usoro nke RNA dị ọcha nwere njirimara ndị a: usoro ahụ dị nro, A230 na A260 bụ ihe ntụgharị abụọ, A300 dị nso na 0, A260/A280 = gburugburu 2.0, na A260/A230 = gburugburu 2.0.Ọ bụrụ na data nyocha adịghị, a ga-ekpebikwa oke A260/A230, n'ihi na oke a na-enwe mmetụta nke ukwuu maka ibufe adịghị ọcha niile na-emetụta mmeghachi omume enzymatic.Buru n'uche usoro ahịrị nke ngwaọrụ ahụ (0.1-0.5 maka A260).
E nwere ihe abụọ ọzọ bara uru: nha ga-abụ ihe dịka 0.3 ala mgbe A260 / A280 tụrụ na mmiri;ebe oke a tụrụ na 10 mM EDTA dị ihe dịka 0.2 dị elu karịa nke a tụrụ na 1 mM EDTA.
Ngwaahịa ndị emetụtara:
RNA kewapụrụ usoro Suppliers na Factory |Ndị na-emepụta usoro iche iche China RNA (foreivd.com)
Usoro iche iche RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Oge nzipu: Jul-15-2022
