1. Nghọta mbụ

N'oge a, anyị kwesịrị ịghọta ụfọdụ echiche na okwu okwu, ka anyị wee zere imehie ihe n'ihu ndị agadi anyị, dịka:

Ajụjụ: Gịnị bụ ihe dị iche n'etiti RT-PCR, qPCR, PCR oge na ezigbo oge RT-PCR?

Azịza: RT-PCR bụ PCR ntụgharị ntụgharị(PCR ntụgharị ntụgharị, RT-PCR), nke bụ ụdị mmeghachi omume polymerase (PCR).Na RT-PCR, a na-atụgharị eriri RNA ka ọ bụrụ DNA nkwado, nke a na-eji dị ka ndebiri maka mmụba DNA site na PCR.
Ezigbo oge-PCR na qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) bụ otu ihe ahụ, ha abụọ bụ PCR n'ezie, nke pụtara na okirikiri PCR ọ bụla nwere ndekọ data oge, yabụ enwere ike ịhazi ọnụọgụ mmalite nke ndebiri nke ọma.

Ọ bụ ezie na ma PCR Real-time (ezigbo fluorescent quantitative PCR) na Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) yiri ka a ga-akpọbiri dị ka RT-PCR, mgbakọ mba ụwa bụ: RT-PCR na-ezo aka kpọmkwem na ntụgharị ntụgharị.PCR, ezigbo oge PCR ka a na-akpọchitere dị ka qPCR (ọnụọgụ ezigbo oge PCR).

Na ezigbo oge RT-PCR (RT-qPCR), Ọ bụ PCR ntụgharị ntụgharị yana teknụzụ fluorescent quantitative.: buru ụzọ nweta cDNA (RT) site na ntụgharị ntụgharị RNA, wee jiri PCR ezigbo oge maka nyocha ọnụọgụ (qPCR).Ọtụtụ ụlọ nyocha na-eme RT-qPCR, ya bụ, nyocha na usoro RNA na-agbadata, yabụ qPCR nke onye ọ bụla na-ekwu maka ya na ụlọ nyocha na-ezo aka na RT-qPCR n'ezie, mana echefula na a ka nwere ọtụtụ nnwale DNA na ngwa ụlọ ọgwụ.Nyocha ọnụọgụ, dị ka nje ịba ọcha n'anya B nchọpụta HBV.

Ajụjụ: Mgbe ị gụchara ọtụtụ PCR fluorescent quantitative, gịnị kpatara a ga-eji chịkwaa mpekere ahụ n'ime oke 80-300bp?

Zaa: Ogologo nke usoro mkpụrụ ndụ ọ bụla dị iche, ụfọdụ bụ ọtụtụ kb, ụfọdụ bụ narị narị bp, mana naanị anyị chọrọ ka ogologo ngwaahịa ahụ bụrụ 80-300bp mgbe ị na-emepụta primers, mkpụmkpụ ma ọ bụ ogologo adịghị adabara nchọpụta PCR nke fluorescent quantitative.Iberibe ngwaahịa dị oke mkpụmkpụ ka a mata ọdịiche dị na primer-dimer.Ogologo nke primer-dimer dị ihe dịka 30-40bp, ọ na-esikwa ike ịmata ma ọ bụ primer-dimer ma ọ bụ ngwaahịa ma ọ bụrụ na ọ na-erughị 80bp.Ọ bụrụ na iberibe ngwaahịa ahụ dị ogologo, gafere 300bp, ọ ga-adị mfe na-eduga n'ịrụ ọrụ nkwalite dị ala na enweghị ike ịchọpụta ọnụọgụ mkpụrụ ndụ ihe nketa nke ọma.

Dịka ọmụmaatụ, mgbe ị gụrụ mmadụ ole nọ na klaasị, naanị ị ga-agụta ọnụ ole dị.Otu ihe ahụ bụ mgbe ịchọtara mkpụrụ ndụ ihe nketa, naanị ị ga-achọ ịchọpụta usoro nke mkpụrụ ndụ ihe nketa ka ọ bụrụ usoro niile ga-eme.Ọ bụrụ na ịchọrọ ịgụta ndị mmadụ, ịkwesịrị ịgụ ma ọnụ ma imi, ntị na ugogbe anya, ọ dịkwa mfe imejọ ihe.

Iji gbasaa, na nyocha nke ndu, enwere ọtụtụ nyocha site n'ókè ruo na mpaghara, n'ihi na usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa nke ụdị ọ bụla dị ogologo, ọ dịghị mkpa na ọ gaghị ekwe omume ịlele mpekere niile, dị ka usoro nje 16S nke nje, nke bụ iji mepụta usoro mgbanwe nke nje bacteria na-enyocha ọnụ ọgụgụ nke ụfọdụ ndị bi na nje bacteria.

Ajụjụ: Gịnị bụ ogologo kacha mma maka qPCR primer imewe?

Zaa: N'ikwu okwu n'ozuzu, ogologo primer bụ ihe dịka 20-24bp, nke ka mma.N'ezie, anyị ga-aṅa ntị na uru TM nke primer mgbe ị na-emepụta primer, n'ihi na nke a metụtara okpomọkụ kachasị mma.Mgbe ọtụtụ nnwale gasịrị, egosila na 60°C bụ uru TM ka mma.Ọ bụrụ na okpomọkụ na-ekpo ọkụ dị oke ala, ọ ga-adị mfe na-eduga na nkwalite na-abụghị nke akọwapụtara.Ọ bụrụ na okpomọkụ na-eme ka ọ dị elu dị elu, arụmọrụ nrịbawanye ga-adị ntakịrị, ọnụ ọgụgụ kasị elu nke mgbatị ahụ ga-amalite ma emesịa, uru CT ga-egbu oge.

Ajụjụ: Kedu ka usoro agba agba si dị iche na usoro nyocha?

Azịza: Usoro agba agbaỤfọdụ ihe e ji esiji fluorescent, dị ka SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, wdg, adịghị amụnye ọkụ n'onwe ha, kama ha ga-ekupụta fluorescence mgbe ejikọtara ya na obere oghere nke DNA nwere eriri abụọ.Ya mere, na mmalite nke mmeghachi omume PCR, igwe enweghị ike ịchọpụta mgbaàmà fluorescent.Mgbe mmeghachi omume ahụ rutere n'ọkwa mgbatị mgbatị ahụ, a na-emeghe eriri abụọ ahụ, a na-emepụta eriri ọhụrụ n'okpuru ọrụ nke DNA polymerase, na molecule fluorescent na-ejikọta na dsDNA obere oghere.Ka ọnụ ọgụgụ nke okirikiri PCR na-abawanye, a na-ejikọta ọtụtụ agba na DNA nwere eriri abụọ, na mgbama fluorescent na-aga n'ihu.A na-eji usoro agba agba eme ihe na nyocha sayensị.
PS: Kpachara anya mgbe ị na-eme nnwale ahụ, a ga-ejikọta agba na DNA mmadụ, kpachara anya ka ọ bụrụ onye na-egbuke egbuke.

Usoro agba agba (aka ekpe) Usoro nyocha (aka nri)
PS: Kpachara anya mgbe ị na-eme nnwale ahụ, a ga-ejikọta agba na DNA mmadụ, kpachara anya ka ọ bụrụ onye na-egbuke egbuke.

SYBR Green Ⅰ na-ejikọta na obere oghere nke DNA

Usoro nyochaNyocha Taqman bụ nyocha hydrolysis nke a na-ejikarị eme ihe.Enwere otu fluorescent na njedebe 5′ nke nyocha ahụ, na-abụkarị FAM, nyocha n'onwe ya bụ usoro na-akwado mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ.Enwere otu ndị na-emenyụ fluorescent na njedebe 3′.Dị ka ụkpụrụ nke fluorescence resonance energy transfer (Förster resonance energy transfer, FRET), mgbe onye nta akụkọ fluorescent otu (enye onyinye fluorescent molekul) na quenching fluorescent otu (nabata fluorescent molecule) na-enwe obi ụtọ Mgbe spectra overlap na anya dị nnọọ nso (7-10nm nke molecule nke nwere ike na-anabata nke fluorescent). molecule, ebe autofluorescence na-ebelata.Ya mere, na mmalite nke mmeghachi omume PCR, mgbe nyocha ahụ nwere onwe ya na nke na-adịghị mma na usoro ahụ, ndị nta akụkọ fluorescent otu agaghị eme ka ọ pụta ìhè.Mgbe ị na-ehichapụ, primer na nyocha na-ejikọta na template.N'oge mgbatị ahụ, polymerase na-ejikọta ụdọ ọhụrụ.DNA polymerase nwere 5′-3′ exonuclease ọrụ.Mgbe ị na-erute nyocha ahụ, DNA polymerase ga-eme ka nyocha ahụ dị na template, kewapụ ndị nta akụkọ fluorescent otu na otu quencher fluorescent otu, ma hapụ akara ngosi fluorescent.Ebe ọ bụ na enwere mmekọrịta n'otu n'otu n'etiti nyocha na template, usoro nyocha dị elu karịa usoro agba agba n'ihe ziri ezi na nghọta nke ule.A na-eji usoro nyocha eme ihe na nyocha.

Ajụjụ: Gịnị bụ nkọwa zuru oke?Kedu ihe bụ Relative Quantification?

ZaaNkọwapụta zuru oke na-ezo aka na ngụkọ nke nọmba nnomi mbụ nke nlele nke qPCR ga-anwale, dị ka nje nje HBV ole dị na 1ml ọbara.Nsonaazụ enwetara site na nleba anya nke ikwu bụ ngbanwe nke ọnụọgụ mkpụrụ ndụ ihe ezubere iche n'otu nlele akọwapụtara na nlele ọzọ, yana usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa na-achịkwa ma ọ bụ gbadaa ala.

Ajụjụ: Ọnụ ego nke mmịpụta RNA, ntụgharị ntụgharị, na arụmọrụ nkwalite ọ ga-emetụta nsonaazụ nnwale ahụ?
Ajụjụ: Ihe nchekwa nlele, ihe nrụpụta ihe, reagents reagent transcription, na ihe ndị na-ebunye ọkụ ga-emetụta nsonaazụ nnwale ahụ?
Ajụjụ: Kedu usoro nwere ike idozi data nnwale?

Banyere okwu ndị a, anyị ga-akọwa ha n'ụzọ zuru ezu na ngalaba dị elu na nke dị elu n'okpuru.
2. Ọmụma dị elu

N'ihe gbasara ezigbo oge fluorescent quantitative PCR, anyị ga-amata eziokwu ahụ bụ na a na-ebipụta ọtụtụ puku akwụkwọ nyocha sayensị kwa afọ, n'ime nke teknụzụ fluorescent quantitative PCR abụghị ọnụ ọgụgụ dị nta.

Ọ bụrụ na enweghị ọkọlọtọ a na-ahụkarị iji tụọ nnwale PCR fluorescent quantitative, nsonaazụ ya nwere ike ịdị iche iche.Maka otu mkpụrụ ndụ ihe nketa nke otu ụdị, n'otu usoro nhazi ahụ, nsonaazụ nchọpụta ga-adịgasị iche iche, ọ ga-esikwa ike ndị na-abịa n'azụ imeghachi otu nsonaazụ ahụ.Ị Ọ dịghị onye maara nke ziri ezi na nke bụ ihe ọjọọ.

Nke a ọ pụtara na fluorescent quantitative PCR bụ teknụzụ aghụghọ ma ọ bụ teknụzụ enweghị ntụkwasị obi?Mba, ọ bụ n'ihi na fluorescent quantitative PCR na-enwe mmetụta nke ọma na nke ziri ezi karị, na obere ọrụ na-ezighị ezi ga-arụpụta nsonaazụ na-adịghị mma.Obere mfu dị otu puku maịl.Ndị nyocha nwere ike ịta onye dere akụkọ ahụ ahụhụ ugboro ugboro.N'otu oge ahụ, ndị na-enyocha akwụkwọ akụkọ na-esikwa ike ịhọrọ site na nsonaazụ nnwale dị iche iche.

Na mkpokọta, na-arụtụ aka na enweghị nkwenye na nnwale PCR ozugbo.Iji mezuo nke a, ndị ọkà mmụta sayensị dị elu na ụlọ ọrụ ahụ malitere ịmepụta ụkpụrụ,na-achọ ka ndị ntinye aka nye ụfọdụ nkọwa nnwale dị mkpa na nhazi data (gụnyere data dị mkpa) n'isiokwu iji mezuo ụkpụrụ ndị a.

Ndị na-enyocha nwere ike ikpebi àgwà nnwale ahụ site n'ịgụ nkọwa ndị a;Ndị na-agụ akwụkwọ n'ọdịnihu nwekwara ike iji nke a megharịa nnwale ma ọ bụ melite nnwale.Mgbe ahụ, nsonaazụ nnwale enwetara n'ụzọ dị otu a juputara na ozi, ịdị mma dị elu, yana enwere ike iji ya.

MIBBI (Opekempe ozi maka nyocha ihe gbasara ndu na ndu -http://www.mibbi.org) bịara dịrị.MIBBI bụ ọrụ na-enye ụkpụrụ maka nnwale.A na-ebipụta ya na okike.Arụ ọrụ a bụ maka nnwale dị iche iche nke ndu, gụnyere usoro ihe ọmụmụ cell, Microarray, qPCR anyị ga-atụle ugbu a, wdg, ma na-enye ụdị nnwale ọ bụla mgbe ị na-edobe ihe odide.Ekwesịrị ịnye ozi ahụ oge niile.

N'ime ọrụ MIBBI, enwere akụkọ abụọ metụtara PCR fluorescent quantitative, ya bụ:
· RDML (Asụsụ nrịbama data PCR n'ezie) - asụsụ ahaziri ahazi na ntuziaka mkpesa maka data PCR n'ezie;
· MIQE (Opekempe Ozi maka mbipụta nke Quantitative Real-Time PCR Experiments) - ozi kacha nta maka ibipụta akụkọ gbasara nnwale PCR n'ezie.
Nke mbụ, ka anyị kwuo maka RDML, nkọwapụta okwu.

Ọ bụrụ na enweghị nkọwa ọkọlọtọ maka ihe niile, ọ gaghị ekwe omume ịga n'ihu na mkparịta ụka ahụ, ya mere nkọwa nke okwu dị oke mkpa na nyocha ahụ.
Okwu eji mee ihe na nnwale PCR fluorescent quantitative gụnyere ọdịnaya ndị a.QIAGEN emeela anyị nchịkọta kacha mma.Ihe ndị a niile akpọnwụwongwongwo .

Usoro nkwalite
Usoro nkwuwa okwu na-ezo aka n'okirikiri emere n'oge usoro PCR, yana ọnụọgụ okirikiri dị ka abscissa na ezigbo oge fluorescence siri ike n'oge mmeghachi omume dị ka ordinate.

Ọkpụkpọ mmụba dị mma kwesịrị inwe njirimara ndị a: ntọala ahụ dị larịị ma ọ bụ dị ntakịrị belata, ọ dịghịkwa ihe na-eme n'elu elu;Ntugharị ntụgharị nke ntụgharị ahụ doro anya, na mkpọda nke oge nkwuputa na-adaba na arụmọrụ mmụba.Ọganihu nke mkpọda ahụ, na-abawanye arụmọrụ nkwuputa;n'ozuzu nkwuputa usoro Ntugharị ahụ dị mma, na-egosi na arụmọrụ nkwalite nke tube ọ bụla yiri ya;usoro nkwuputa nke nkwuputa nkwuputa nke ihe nleba anya di ala doro anya.

Ntọala (Ntọala)
Ihe ndabere bụ ọkwa mkpọtụ nke okirikiri mmalite, a na-atụkarị n'etiti okirikiri nke 3 na nke 15, n'ihi na mmụba nke fluorescence nke ngwaahịa mmụba kpatara enweghị ike ịhụ n'oge a.Ọnụọgụ okirikiri ejiri gbakọọ ntọala nwere ike ịdịgasị iche ma nwee ike belata ma ọ bụrụ na ejiri oke ndebiri dị elu ma ọ bụ ọ bụrụ na ọkwa ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ebumnuche dị elu.

Ịtọ ntọala ntọala chọrọ ikiri data fluorescence site na usoro mmụba linearity.A na-edobe akara ala ka uto nke mgbago nkwuwapụta ga-amalite site na ọnụọgụ okirikiri karịrị ọnụ ọgụgụ elu okirikiri ntọala.Ekwesịrị ịtọ ntọala ntọala n'otu n'otu maka usoro ebumnuche ọ bụla.Ọ dị mkpa ka ewepụrụ nkezi ụkpụrụ fluorescence achọpụtara na okirikiri mmalite na ụkpụrụ fluorescence enwetara na ngwaahịa ndị agbakwunyere.Ụdị sọftụwia PCR Real-Time kachasị ọhụrụ na-enye ohere nkwalite akpaka nke ntọala ntọala maka nlele n'otu n'otu.

N'ime okirikiri ole na ole mbụ nke mmeghachi omume mmụba PCR, mgbama fluorescence anaghị agbanwe nke ukwuu.Ịbịaru nso n'ahịrị kwụ ọtọ ka a na-akpọ baseline, ma ọ bụrụ na anyị eleru anya na okirikiri nke mbụ, anyị na-ahụ na n'ime ntọala bụ ihe na-eme na foto dị n'okpuru ebe a.

Ndabere ndabere na-ezo aka
uru fluorescence na-abụghị nke akọwapụtara na mmeghachi omume.Ọmụmaatụ: adịghị arụ ọrụ fluorescence quenching;ma ọ bụ ọnụ ọgụgụ buru ibu nke ndebiri DNA nwere eriri abụọ n'ihi iji SYBR Green.Ngwanrọ PCR Real-Time bụ algọridim na-ewepụ akụkụ azụ nke mgbama ahụ na mgbakọ na mwepụ.

Mgbama onye nta akụkọ
Mgbama ndị nta akụkọ na-ezo aka na mgbama fluorescent nke SYBR Green mepụtara ma ọ bụ nyocha nke akpọrọ fluorescent na usoro akọwapụtara n'oge PCR Real-Time.

Mgbama ndị nta akụkọ ahaziri ahazi (RN)
RN na-ezo aka na ncha ọkụ ọkụ nke onye nta akụkọ na-esijiji kewara site na ncha ọkụ ọkụ nke agba ntụ ntụ na-agafe agafe nke a tụrụ na okirikiri nke ọ bụla.

Ntụaka ihe eji agbaji
N'ime ụfọdụ PCR Real-Time,a na-eji ROX fluorescent dye ROX dị ka ihe nrụtụ aka dị n'ime iji mee ka mgbama fluorescent normalize.Ọ na-edozi maka mgbanwe dị iche iche n'ihi ọkpọkọ na-ezighị ezi, ọnọdụ dị mma, na fluorescence mgbanwe na-adabere na nke ọma.

Ọnụ ụzọ fluorescence (ọnụ ụzọ)
emeziri n'elu uru ndabere yana nke ukwuu n'okpuru uru ala dị larịị nke usoro mmụba.Ọ ga-edinarịrị na mpaghara ahịrị ahịrị nke mgbago mmụba, na-anọchi anya ọnụọgụ log-linear nke nchọpụta PCR.Ekwesịrị idobe ọnụ ụzọ n'ihe nlele log-amplification curve ka enwere ike ịmata usoro log-linear nke PCR ngwa ngwa.Ọ bụrụ na enwere ọtụtụ mkpụrụ ndụ ihe nleba anya na PCR Real-Time, a ga-edozi ọnụ ụzọ maka ebumnuche ọ bụla.N'ozuzu, a na-eji mgbaàmà fluorescence nke usoro 15 mbụ nke mmeghachi omume PCR dị ka mgbaàmà ndabere nke fluorescence, na ọnụ ọgụgụ nke fluorescence bụ ugboro 10 nke ọkọlọtọ fluorescence mgbaàmà nke mbụ 3 ruo 15 cycles nke PCR, na fluorescence threshold ka edobere n'usoro nke PCRl amps.N'ozuzu, ngwá ọrụ ọ bụla nwere ọnụ ụzọ fluorescence nke edobere tupu eji ya.

Ọnụ ụzọ okirikiri (CT) ma ọ bụ ebe gafere (CP)
Okirikiri nke usoro nkwuwapụta ahụ na-agafe n'ọnụ ụzọ (ya bụ, ebe nchọpụta fluorescence na-abawanye nke ukwuu).CT nwere ike ịbụ akụkụ dị nta na ọnụọgụ mmalite nke template nwere ike gbakọọ.Uru CT na-anọchi anya ọnụọgụ okirikiri nke enwetara mgbe mgbama fluorescent dị na tube mmeghachi omume PCR ọ bụla rutere n'ọnụ ụzọ edobere.Enwere njikọ ahịrị n'etiti uru CT nke ndebiri ọ bụla yana logarithm nke nọmba mbụ nke ndebiri,dị elu karịa nọmba nnomi mbụ, uru CT dị ntakịrị, ma ọzọ.Enwere ike ịme usoro ọkọlọtọ site na iji ọkọlọtọ nwere nọmba nnomi izizi amaara, ebe abscissa nọchiri anya uru CT, na ordinate na-anọchi anya logarithm nke nọmba nnomi mbụ.Ya mere, ọ bụrụhaala na enwetara uru CT nke ihe nlele a na-amaghị, enwere ike gbakọọ nọmba mbụ nke ihe nlele ahụ site na ọkọlọtọ ọkọlọtọ.

ΔCT uru
ΔCT uru na-akọwaọdịiche dị n'etiti mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ yana uru CT ntụnyere endogenous kwekọrọ, dị ka mkpụrụ ndụ ihe nketa ụlọ, a na-ejikwa mee ka ọnụ ọgụgụ nke ndebiri ejiri mee ka ọ dị mma:
⇒ΔCT = CT (mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ) - CT ( gene ntụaka endogenous )

ΔΔCT Uru
Uru ΔΔCT na-akọwa ọdịiche dị n'etiti uru ΔΔCT nke ihe atụ nke mmasị (dịka ọmụmaatụ, mkpụrụ ndụ akpali akpali) na uru ΔΔCT nke ihe nrịbama (dịka ọmụmaatụ, sel ndị na-enweghị ike).A na-akpọkwa ihe nrụtụaka ahụ ihe nlegharị anya na ihe nlele ndị ọzọ niile bụ nke a na-ahazi maka nke a maka nleba anya:
⇒ΔΔCT = nkezi ΔCT (ihe atụ nke mmasị) - nkezi ΔCT (ntụgharị aka)

Mkpụrụ ndụ ihe nketa endogenous (genes reference genes)
Ọkwa okwu nke mkpụrụ ndụ ihe nleba anya endogenous, dị ka mkpụrụ ndụ ihe nketa nke ụlọ (mkpụrụ ndụ ihe nketa ụlọ), adịghị iche n'etiti ihe atụ.Tụnyere ụkpụrụ CT nke mkpụrụ ndụ ihe nleba anya na mkpụrụ ndụ ebumnuche na-enye ohere ka ọkwa ọkwa nke mkpụrụ ndụ ihe nlebara anya ka ọ bụrụ nke ọma ka ọ bụrụ nha ntinye RNA ma ọ bụ cDNA (lee akụkụ nke ụkpụrụ ΔCT dị n'elu).

Mkpụrụ ndụ ihe nketa dị n'ime ziri ezi makaenwere ike imebi RNA ma ọ bụ ọnụnọ nke enzyme inhibitors na nlele RNA, yana ọdịiche dị na ọdịnaya RNA, ntụgharị ntụgharị, nrụpụta nucleic acid, na njikwa nlele.Ka ịhọrọ gene(s) ntụaka kacha mma, anyị megharịrị algọridim ka ọ nye ohere nhọpụta ntụaka kacha mma dabere na ntọala nnwale.

Njikwa ime
Usoro njikwa na-abawanye n'otu mmeghachi omume dị ka usoro ebumnuche ma jiri nyocha dị iche mee nyocha (ya bụ, PCR duplex).A na-ejikarị njikwa ime eme ihe iji wepụ nkwuwa okwu dara ada, dị ka mgbe ahụghị usoro ebumnuche.
Nlereanya nhazi
Nlereanya ntụaka (dịka ọmụmaatụ, RNA sachara nke sitere na ahịrị cell ma ọ bụ anụ ahụ) ejiri n'ịkọpụta ọnụ iji tụnyere ihe nlele ndị ọzọ niile iji chọpụta ọkwa ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa.Ihe nlele nhazi nwere ike ịbụ ihe nlele ọ bụla, mana ọ na-abụkarị njikwa (dịka ọmụmaatụ, ihe nlele na-adịghị edozi ma ọ bụ ihe nlele site na oge efu nke nnwale).

Njikwa ziri ezi
jiri mmeghachi omume nchịkwa namara ichekwa nke template.A na-ejikarị njikwa dị mma na-elele na ntọala primer ma ọ bụ ihe nyocha na-arụ ọrụ nke ọma yana na edoziri mmeghachi omume ahụ nke ọma.

Enweghị njikwa ndebiri (NTC)
Mmeghachi omume nchịkwa nke nwere ihe niile dị mkpa nke mmeghachi omume mmụba ma e wezụga template, nke a na-ejikarị mmiri dochie ya.Ojiji nke NTC nwere ike ịchọta mmetọ nke reagent na-ebute ma ọ bụ DNA mba ọzọ, si otú a na-ahụ na izi ezi na ntụkwasị obi nke data nchọpụta ahụ.Mmụba njikwa NTC na-egosi mmetọ.

Enweghị njikwa RT (NRT)
Usoro mmịpụta RNA nwere ike ịnwe DNA genomic fọdụrụnụ, nke na-emerụ ahụ nke ukwuu na ọ bụ onye mere mpụ na-emetụta ogo data yana onye iro sitere n'okike nke qPCR, yabụ mgbe ị na-emepụta nnwale, a ga-emerịrị ya ka ọ gbasaa naanị nchọpụta RNA.Enwere ụzọ abụọ, otu bụ ịmepụta primers gafee introns, nke ọzọ bụ iwepụ DNA kpamkpam, nke ka mma, nke a ga-atụle ma emechaa.Njikwa NTR bụ enyo anwansi iji chọpụta mmetọ DNA.Ọ bụrụ na enwere mmụba, ọ pụtara na enwere mmetọ.

Ụkpụrụ
Ọkọlọtọ bụ nlere anya nleba anya ama ama ma ọ bụ nọmba nnomi nke a na-eji wuo usoro ọkọlọtọ.Iji hụ na nkwụsi ike nke ọkọlọtọ, a na-agbanyekarị mkpụrụ ndụ mkpụrụ ndụ n'ime plasmid ma jiri ya mee ihe dị ka ọkọlọtọ.

Usoro ọkọlọtọ
a na-agbanyekarị n'ime opekata mpe 5 gradients na ngwaahịa ọkọlọtọ dị ka ọnụọgụ okpukpu abụọ si dị, yana 5 isi ihe na-adọta na nhazi nke uru CT na nọmba nnomi, na isi ihe jikọtara ya ka ọ mepụta akara iji mepụta usoro ọkọlọtọ.Maka akụkụ ọkọlọtọ ọ bụla, ọ dị mkpa ka enyocha ike ya.Ọnụ ahịa mkpọda dara n'etiti -3.3 na -3.8, na ntinye uche ọ bụla na-eme ugboro atọ.Ekwesịrị ịtụfu isi ihe ndị dị nnọọ iche na isi ihe ndị ọzọ.A na-ebute uru CT nke ihe nlele a ga-anwale n'ime usoro ọkọlọtọ, na ọkwa ọkwa nke nlele a ga-anwale nwere ike gbakọọ.

A na-ebute uru CT nke ihe nlele a ga-anwale n'ime usoro ọkọlọtọ, na enwere ike ịgbakọ nọmba mbụ nke ihe nlele a ga-anwale.

Ịrụ ọrụ na mkpọda
Mkpọda nke ọkọlọtọ ọkọlọtọ na-anọchite anya arụmọrụ PCR dị adị.
· Mkpọda nke -3.322 na-egosi na arụmọrụ nkwalite PCR bụ 1, ma ọ bụ 100% nke ọma, na ọnụ ọgụgụ nke ngwaahịa PCR na-abawanye okpukpu abụọ na okirikiri ọ bụla.
Mkpọda na-erughị -3.322 (dịka ọmụmaatụ, -3.8) na-egosi arụmọrụ PCR.
Mkpọda karịrị -3.322 (dịka ọmụmaatụ, -3.0) na-egosi na arụmọrụ PCR na-egosi na ọ karịrị 100%, nke na-achọsi ike, kedu ka otu okirikiri PCR ga-esi nweta ihe karịrị okpukpu abụọ ngwaahịa a gbanyere mkpọrọgwụ?Ọnọdụ a na-eme na usoro nke na-abụghị linear nke mmeghachi omume PCR, ya bụ, enwere nnukwu mmụba nke na-abụghị nke a kapịrị ọnụ.

agbaze agba
Mgbe qPCR nwechara nkwalite, ngwaahịa PCR na-ekpo ọkụ.Ka okpomọkụ na-arị elu, ngwaahịa nkwalite nwere eriri okpukpu abụọ na-agbaze nke nta nke nta, na-ebute mbelata nke ike fluorescence.Mgbe ụfọdụ okpomọkụ (Tm) ruru, ọnụ ọgụgụ buru ibu nke ngwaahịa ga-agbaze.Fluorescence na-ada nke ọma.Ngwaahịa PCR dị iche iche nwere ụkpụrụ Tm dị iche iche yana okpomọkụ na-agbaze dị iche iche, nke mere na enwere ike ịmata kpọmkwem PCR.

Ọkpụkpụ mgbaze (usoro mgbaze)
A na-ewepụta usoro mgbaze ka ọ bụrụ maapụ kacha elu, nke nwere ike igosipụta ọnọdụ nke iberibe ngwaahịa PCR karịa.Ebe ọ bụ na okpomọkụ na-agbaze bụ uru Tm nke iberibe DNA, enwere ike ikpebi ụfọdụ paramita ndị na-emetụta uru Tm nke mpempe DNA, dị ka nha nke mpempe akwụkwọ, ọdịnaya GC, wdg. N'ikwu okwu n'ozuzu, dịka ụkpụrụ nhazi nke mbụ anyị si dị.Ogologo ngwaahịa a na-agbakwunyere dị na nso nke 80-300bp, ya mere okpomọkụ na-agbaze kwesịrị ịdị n'etiti 80 ° C na 90 ° C.

Nkọwa nke mgbaze agbaze: Ọ bụrụ na naanị isi ọnụ ọgụgụ dị n'etiti 80C-90C, ọ pụtara na fluorescent quantitative PCR zuru oke;Ọ bụrụ na ọnụ ọgụgụ kachasị elu na-apụta n'etiti 80 Celsius-90 Celsius C na ọnụ ọgụgụ dị iche iche na-apụta n'okpuru 80 Celsius, a na-eleba anya na primer dimer.Ị nwere ike ịnwa ịbawanye okpomọkụ na-ekpo ọkụ iji dozie ya;Ọ bụrụ na ọnụ ọgụgụ kachasị elu na-apụta n'etiti 80 ° C-90 ° C, ọnụ ọgụgụ dị iche iche na-apụtakwa ọzọ mgbe okpomọkụ na-ebili, a na-ewere ya na enwere nje DNA, na DNA kwesịrị iwepụ na mmalite nke nnwale ahụ.

N'ezie, a ka nwere ọnọdụ ụfọdụ na-adịghị mma, nke a ga-agbaji otu otu n'okpuru.
3. Ọmụma dị elu

Iji mee qPCR, a ga m asị MIQE,Ozi kacha ntamaka mbipụta nkeỌnụ ọgụgụPCR oge niileNnwale — ozi kacha nta maka ibipụta akụkọ gbasara PCR n'ezie - ogennwale .Iji mee ka nghọta onye ọ bụla dị mfe, anyị ga-eme ka ọdịnaya dị mfe dị mfe.

Ị nwere ike ịchọ ederede mbụ nke MIQE na ịntanetị, na ihe kachasị mkpa bụ na ọ na-akọwapụtandepụta data kwesịrị inye mgbe ị na-ebipụta akụkọ .

Ndị na-enyocha nwere ike ikpebi àgwà nnwale ahụ site n'ịgụ nkọwa ndị a;Ndị na-agụ akwụkwọ n'ọdịnihu nwekwara ike iji nke a megharịa ma ọ bụ melite nnwale.
Ọ dị mma ịmara na na ndepụta a, mkpa nke ndepụta ọ bụla ka akara E ma ọ bụ D n'otu n'otu.Kedu ihe ọ pụtara?E: ozi dị mkpa (ga-edozirịrị);D: ozi a na-achọsi ike (nye dị ka o kwere mee).

MIQE (1) — Nleba anya
Ọtụtụ ndị scumbags bụ ndị gụchara ihe nchebe ha ma ha gụchaa akwụkwọ ha agaghị ama otú e si emepụta nnwale n'onwe ha, mepee akwụkwọ ndetu ha, na ime ihe onye nkụzi gwara ha ka ha mee.N'ihi ya, ihe ngosi nnwale ahụ esighị ike, na ngalaba nchịkọta akụkọ nke magazin ahụ kwuru na ha chọrọ ime foto a na foto ahụ, n'ihi ya, ha mere ya n'atụghị egwu.Nke a bụ otú e si eme scumbags!

Na nso ụlọ, ụkpụrụ mbụ nke nnwale ahụ bụ ikpebisiri ike nke mgbagha nnwale.Ihe kachasị mkpa bụ ihe ngosi nnwale, na ihe kachasị mkpa gbasara ihe nlele ahụ bụ ka esi edobe ihe nlele anya, ihe nleba anya (nchịkwa), na ọnụ ọgụgụ nke ugboro ugboro, ka e wee nwee ike ịkọwa data nnwale ahụ, tụnyere, na nkwenye.

The lekwasịrị samplena-ezo aka na nlele nke chọrọ ka anyị chọpụta mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ ka emechara ọgwụgwọ ụfọdụ.Ihe ntụnye akabụ ihe nlele na-enweghị ọgwụgwọ ọ bụla, nke a na-akpọkarị ụdị anụ ọhịa na bayoloji.

Nnwale oyiridị ezigbo mkpa.N'ozuzu, ọnụ ọgụgụ nke mmeghari mmegide ga-abụrịrị ihe karịrị atọ.Ọ dị mkpa ịmata ọdịiche dị n'ihe bụ mmegharị nke ndu na ihe bụ ntụgharị teknụzụ.

Nkwagharị ndu ndu: Otu nnwale nnwale emere na ihe dị iche iche (oge, osisi, batches, efere mmeghachi omume).

Ntugharị ndu
Ka anyị were ọgwụgwọ pesticide nke ose dịka ọmụmaatụ.Anyị chọrọ ịgba ọgwụ pesticides na osisi atọ nke ABC, mgbe ahụ, osisi atọ nke ABC bụ ụdị mkpụrụ ndụ atọ, na ha bụ otu nnwale nkwenye ejiri ihe dị iche iche mee.Ma dị ka nnwale, a akara bụ maa mkpa, otú anyị nwere ike ịgba otu n'ime alaka osisi A na-etolite nnwale otu osisi A, na ọ bụghị ịgbasa ndị ọzọ alaka osisi A na-etolite a akara otu.Mee otu ihe ahụ maka B na C.

Nrụgharị nka nka (Ntugharị nka nka): Ọ bụ nnwale ugboro ugboro emebere iji zere njehie sitere na ọrụ, nke bụ n'ezie oghere oyiri etinyere n'otu ihe.Ma ọgwụgwọ yana njikwa ga-enwerịrị ntọala oyiri (opekempe atọ) nke mkpụrụ ndụ ebumnuche yana mkpụrụ ndụ nrụtụ aka dị n'ime.

Nka na ụzụ ikwugharị
Were ose ejiri ọgwụ pesticide gwọọ ya dịka ọmụmaatụ ọzọ.Maka otu nnwale nke osisi A, anyị mere oghere PCR atọ nke 1, 2, na 3 maka mkpụrụ ndụ ebumnuche ya na mkpụrụ ndụ ihe nrụtụ aka n'ime ya, ka ọ were were nkezi mgbe achọpụtara ya.N'ihi na njikwa nke osisi A Groups na-emeso n'otu ụzọ ahụ.N'otu aka ahụ, mee otu ọgwụgwọ ahụ maka osisi B na C.Nke a bụ ikwugharị teknụzụ.

Okwesiri iburu n'uche naihe na-abanye na ọnụ ọgụgụ bụ ndu ikwugharị, na teknuzu ikwughachi bụ iji nwalee ma e nwere ihe ọ bụla random phenomena na nnwale usoro, nke mere na-eme ka nnwale pụta credible, ya bụ, iji zere njehie site na-ewere ha nkezi dị ka anyị na-ekwukarị.

Njikwa adịghị mma-NTC na NRT
NTC (Njikwa Nkwekọrịta Ọ dịghị), njikwa na-enweghị ndebiri, na-eji nyochaa ma ihe nnwale ahụ emetọọ.N'ozuzu, a na-eji mmiri eme ihe dị ka template.Ọ bụrụ na enwere mmeghachi omume fluorescent, ọ na-egosi na mmetọ nucleic acid emeela na ụlọ nyocha.

Mmetọ ndị a sitere na: mmiri adịghị ọcha, reagents erughị eru nwere DNA endogenous, mmetọ primer, mmetọ akụrụngwa ụlọ nyocha, mmetọ ikuku ikuku, wdg, kwesịrị iji RNase scavengers na RNase inhibitors.Mmetọ ikuku bụ nke kacha sie ike ịchọta.Were ya na ụlọ nyocha gị dị ka smog, nke nwere acid nucleic dị iche iche kwụsịrị na ikuku.

NRT (Ndegharị na-enweghị ntụgharị), njikwa na-enweghị ntụgharị ntụgharị, bụ RNA na-abụghị nke a na-edegharị dịka njikwa na-adịghị mma, nke bụ njikwa gDNA fọdụrụnụ.

Mgbe ị na-eme okwu mkpụrụ ndụ ihe nketa, a na-achọpụta ọnụọgụ RNA site na ịchọpụta ọnụọgụ cDNA ka emechara ntụgharị.Ọ bụrụ na enwere ihe fọdụrụ gDNA mgbe RNA dị ọcha, ọ ga-ebute njehie na nsonaazụ nnwale, n'ihi na nsonaazụ nke enwetara bụ gDNA na cDNA.N'ọkwa mkpokọta, ọ bụghị naanị cDNA, gDNA kwesịrị iwepụ kpamkpam n'oge mmịpụta RNA.

MIQE (2)—ozi nlele
Ihe a na-akpọ ozi nlele pụtara na mgbe anyị na-ebipụta akụkọ gbasara qPCR, anyị ga-akọwarịrị ozi nlele nke ọma, nke bụ akụkụ dị mkpa nke akụkọ ahụ.N'otu aka ahụ, mgbe anyị na-ahazi samples, anyị ga-edozikwa nke anyị ọrụ iji hụ na irè nke samples.

Nkọwa nke ihe nlele ahụ bụ naanị nsonaazụ, anyị kwesịrị itinyekwu uche na ihe ndị e weere n'oge nnwale ahụ dum.

Nhọrọ nke ihe nnwale
Ihe nlele ọbara - họrọ ọbara ọhụrụ, ọ bụghị ihe karịrị awa anọ.Ihe nlele cell – họrọ ịnakọta mkpụrụ ndụ ọhụrụ n'oge uto siri ike.Anụ anụmanụ—Họrọ anụ ahụ dị ọhụrụ, na-etosi ike.Osisi Osisi - Họrọ anụ ahụ ọhụrụ, na-eto eto.

Ọ ga-abụrịrị na ị chọpụtala na e nwere mkpụrụokwu dị mkpa n'ahịrịokwu ole na ole a: ọhụrụ .
Maka ihe atụ ndị a dị n'elu, ngwa kacha mma, dị ọnụ ahịa na nke kwụsiri ike n'ahịa bụ ngwa Foregene, nke nwere ike wepụ DNA na RNA ha ngwa ngwa ngwa ngwa.

Obere ngwa DNA

Ngwakọta mkpokọta cell RNA iche

Ngwakọta Mkpokọta RNA anụmanụ

Ngwakọta Mkpokọta ihe ọkụkụ RNA

Ngwakọta ihe ọkụkụ RNA dịpụrụ adịpụ Plus

Ngwa nkewapụta DNA osisi

Nchekwa nke ihe nnwale
N'ikwu okwu n'ozuzu, anyị anaghị akwado ịchekwa ihe nlele, ma ọ bụrụ na ọnọdụ kwere.Otú ọ dị, e nwere ọtụtụ ndị enyi na-enweghị ike ime nnwale ozugbo ha nyochachara, ụfọdụ na-adịkwa mkpa iburu tankị nitrogen mmiri n'ubi maka nlele.

Maka ụdị enyi na-arụsi ọrụ ike, enwere m ike ịsị na ị naghị aghọta ihe oriri reagent.Ugbu a ọtụtụ ụlọ ọrụ reagent na-ere ihe na-emepụta reagents nke nwere ike ịchekwa ihe nlele RNA na ọnụ ụlọ, ma ị nwere ike họrọ iji ha.Usoro nchekwa a na-emekarị bụ nchekwa mmiri nitrogen, na-eji obere mmiri nitrogen tank nke dị mfe iburu.Mgbe iweghachite ihe nlele ahụ na ụlọ nyocha, chekwaa ya na friji -80 Celsius.

Maka nnwale ndị metụtara RNA, a ga-agbaso ụkpụrụ okwu isii:obere okpomọkụ, enweghị enzymes,nangwa ngwa .

Echiche nke obere okpomọkụ dị mfe nghọta;na-enweghị enzymes, RNase nọ n'ebe nile n'ụwa anyị bi (ma ọ bụghị na ị gaara egbu HIV), otú e si ezere RNase mgbe eme nnwale bụ a dị oké mkpa echiche;ngwa ngwa,Enweghị Kung Fu n'ụwa nke enweghị ike ịgbaji, naanị ọsọ enweghị ike ịgbaji.

Ya mere, n'echiche, ka oge mmịpụta dị mkpụmkpụ, ka kit ka mma.Gịnị mereMbido's kit na-emesi ọsọ ọsọ ike, n'ihi na ha maara ya nke ọma.

PS: Ụfọdụ ụmụ agbọghọ na-eji nlezianya eme nnwale, mana ha adịghị mma dị ka slam dunk mgbe ọtụtụ afọ nke ọrụ gasịrị.Ha chere na Chineke adịghị mma, na-eme mkpesa banyere ndị ọzọ, na-achọkwa ndụ.N'ezie, ọ ghọtaghị ya.Ọ naghị echebe RNA nke ọma, onye na-egwu slam dunk dịkwa mma.Mgbe ọ na-eme nnwale ahụ, o chere na ya ga-emecha slam dunk ugboro atọ, ugboro ise na nkewa abụọ, ma o mere nnwale ahụ nke ọma.

Rịba ama: Nwayọọ nwayọọ, ohere karịa nke mbuso agha RNase.Kedu ka esi azụ onwe gị ka ọ bụrụ ngwa ngwa?Enweghị ụzọ, na-emekwu ihe.

Maka nnwale dị iche iche na ụdị dị iche iche, ọ ka dị mkpa ịgụkwu akwụkwọ ma họrọ usoro kwesịrị ekwesị maka nhazi.Maka usoro nchịkọta ihe atụ na nchekwa, MIQE chọrọ ka e dee ya nke ọma na akwụkwọ ahụ, ka ndị na-enyocha ya wee nyochaa ntụkwasị obi nke akwụkwọ ahụ, ọ dịkwa mma maka ndị na-eto eto na-eju anya ịmeghachi nnwale gị.

Ọ bụ ezie na nnwale ndị dị ndụ siri ike, ha dị elu.Ọ bụrụ na ị kpachapụghị anya, ị nwere ike ịkwatu ụwa.Dịka ọmụmaatụ, ime SARS ka ọ bụrụ nsogbu biochemical, ma ọ bụ ime osikapa ngwakọ iji zọpụta mmadụ ijeri 1.3.Foto dị n'okpuru ebe a bụ nnwale kemịkalụ, ị kwesịrị ịghọta etu ị si dị mpako maka nyocha gị naanị site n'ile anya n'ọdịdị dick ya.Chefuo ya, etinyela ya oji.

MIQE (3) - mmịpụta nucleic acid.
Mwepụta nucleic acid bụ nnukwu ihe omume, na nyocha usoro ihe ọmụmụ ihe niile na-amalite site na mmịpụta nucleic acid.Nke mbụ, ka anyị detuo ọdịnaya MIQE na mmịpụta acid nucleic.

N'ileghachi anya n'ụdị a, ị nweghị ike ịnọ n'elu.Ụdị ahụ bụ dogma.Iji bụrụ nwa akwụkwọ kacha elu, ị ga-ajụrịrị ihe kpatara ya.Ihe dị mkpa dị na tebụl a bụ: Na-achụịdị ọcha, iguzosi ike n'ezi ihe, nkwekọ, na ọnụọgụ mmịpụta nke RNA .

Akụkụ mbụ nkeUsoro ma ọ bụ ngwá ọrụ bụ usoro mmịpụta nucleic acid.Ọ bụrụ na ị na-eji ihe mgbapụta nucleic acid na-akpaghị aka wepụ (nke dị elu, biko kpọtụrụ m maka ịzụta), ịkwesịrị igosi aha ihe nlereanya nke ngwá ọrụ ahụ.

Aha ngwa na

ihe kit e ji mee ihe maka mgbanwe nkọwa, ihe pụrụ iche reagents e kwukwara ma ọ bụ ihe pụrụ iche arụmọrụ e mere kwesịrị kọwara n'ụzọ doro anya nke mere na ndị ọzọ nwere ike mfe ikwugharị gị nnwale.

Ụfọdụ ndị na-agbakwunye ụfọdụ reagents pụrụ iche mgbe ha na-ewepụta ihe nlele pụrụ iche, na-eche na nke a bụ ngwa nzuzo ha ma ghara ịgwa ndị ọzọ.Ka ha na-echekwa ya na nzuzo, ha na-atụfukwa ohere ime ka akụkọ gị na-enwu.Adịla akọ, ị ga-eme ihe n'eziokwu karịa obodo ochie Zhang na nyocha sayensị, ọ bụrụ na ịchọrọ ịbụ onye amamihe, isiokwu ahụ ga-eme ka ị bụrụ onye nzuzu.

ga-echeta nọmba ngwaahịa nke ngwa ahụmgbe ị na-atụ ihe kit wee dee akụkọ ahụ.Enwere ọnụọgụ abụọ n'ozuzu na ngwa ahụ: Cat-nọmba katalọgụ (nọmba ngwaahịa, nọmba isiokwu), Lot-nọmba ngwaahịa (A na-eji egosi ogbe ngwaahịa ahụ sitere).

Na mgbakwunye, a na-ejikarị nọmba CAS eme ihe mgbe ị na-atụnye reagents biochemical, m ga-agbasa ya ọnụ.Nọmba CAS bụ ọnụọgụ nke American Chemical Society nyere ọgwụ kemịkal ọhụrụ ọ bụla.Na mkpokọta, ọnụọgụ atọ ejikọrọ site na dash.Nọmba CAS nke Rushui: 7732-18-5.Chemicals na-enwekarị ọtụtụ aha, mana ọnụọgụ CAS pụrụ iche.Mgbe ị na-enye iwu ọgwụ, ị nwere ike buru ụzọ lelee nọmba CAS ya.

N'ebe obibi dị nso, gịnị kpatara anyị ji akọwa ihe ndị a nke ọma?N'ezie, ọ bụkwa iji lelee ogo mmịpụta RNA.Iji ngwa na ngwa ga-eme ka mmịpụta RNA na-agbanwe agbanwe.Ọnụ ọgụgụ mmịpụta nke ụlọ nyocha ndị nkịtị abụghị nnukwu, enwere ike nweta ya na ngwa.

Nkọwa nke ọgwụgwọ DNAse ma ọ bụ RNase
Okwu dị mkpa nke fluorescent quantitative PCR bụ igbochi mmetọ DNA, ma anwalela ma ọ bụrụ na enwere mmetọ.Ya mere, ọ dị mkpa ikwupụta usoro ị na-eji na-edozi DNA, iji gosi na DNA na usoro nyocha ahụ ewepụla kpamkpam na kpamkpam.Eserese na-anọchi anya ya.

Ihe eserese nke RNA na DNA
N'ozuzu, usoro maka iwepụ DNA bụ iji DNAse agwọ RNA ma e wepụchara ya.Agbanyeghị, ndị a bụ ụzọ ochie.Ngwa mmịpụta RNA nke azụmahịa enweela ike iwepu DNA n'oge usoro mmịpụta na-agbakwunyeghị DNAse.Dịka ọmụmaatụ, usoro ngwa ngwa sitere na Foregene.

Rịba ama: Iwepụ DNA n'oge mmịpụta RNA bụ mma agha ihu abụọ dị oke egwu, nke ga-agbatị oge ọrụ nke mmịpụta RNA ma mee ka ohere nke mbibi RNA dịkwuo elu.N'ụzọ bụ isi, ọ bụ mgbanwe n'etiti mkpụrụ RNA na ịdị ọcha.

Tụkwasị na nke ahụ, ọnụọgụ DNA nke agbakwunyere na kọlụm mgbasa ozi silica dabeere na silica dị ntakịrị, na a ghaghị iji DNase dị elu mee ihe iji nweta mmetụta ahụ.Enweghị ike ịgbari DNAse na-enweghị nke ọma ngwa ngwa yana kpamkpam.Nke a bụ nnwale nke ọkwa teknụzụ nke onye ahịa.N'ezie, e nwere ọbụna ndị ahịa dị iche iche na-anya isi na a pụrụ iwepụ DNA na-enweghị DNA.Enwere ike ịsị na onye ọ bụla na-etu ọnụ na DNA nwere ike iwepụ kpamkpam na-enweghị DNA bụ hooligan.DNA bụ ihe kwụsiri ike nke nwere eriri abụọ, a pụghịkwa ikpochapụ ya naanị site n'ikwu okwu na ịchị ọchị.

Ntụle mmetọ
usoro nyocha: nchọpụta electrophoresis, 1% agarose, 6V / cm, 15min, loading 1-3 ul

Nucleic acid quantitative analysis
a na-atụkarị ya site na iji ihe nlele UV.Ka m buru ụzọ mee ka ụkpụrụ atọ nke OD260, OD280 na OD230 pụta ìhè.
· OD260nm: Ọ bụ ogologo ogologo mmịpụta nke ọnụ ọgụgụ kacha elu nke nucleic acid, na uru kacha mma tụrụ sitere na 0.1 ruo 1.0.Ọ bụrụ na ọ bụghị, gbanye ma ọ bụ tinye uche na nlele ka iweta ya n'ime oke.
· OD280nm: Ọ bụ ogologo ogologo mmịpụta nke protein kachasị elu nke protein na ihe phenolic.
· OD230nm: Ọ bụ ogologo ogologo mmịpụta nke ọnụ ọgụgụ kacha elu nke carbohydrates.

Ọzọ, ka anyị kwuo banyere ọrụ nke ihe ngosi ọ bụla.Maka A260, enwere ike iji ya tụọ mkpụrụ nke nucleic acid.Mgbe OD260 = 1, dsDNA = 50μg/ml, ssDNA = 37μg/ml, RNA = 40μg/ml.

Maka ịdị ọcha, anyị kwesịrị ileba anya na oke anyị na-ahụkarị: OD260/280 na OD260/230.
DNA dị ọcha: OD260/280 bụ ihe dịka 1.8.Mgbe ọ karịrị 1.9, ọ na-egosi na e nwere mmetọ RNA, na mgbe ọ na-erughị 1.6, ọ na-egosi na e nwere protein na phenol mmetọ.
· RNA dị ọcha: 1.7
· OD260/230: Ma ọ bụ DNA ma ọ bụ RNA, uru ntụaka bụ 2.5.Mgbe ọ na-erughị 2.0, ọ na-egosi na enwere mmetọ nke shuga, nnu na ihe ndị dị ndụ.

RNA iguzosi ike n'ezi ihe

Ọ dị ezigbo mkpa ịlele iguzosi ike n'ezi ihe nke RNA.N'ozuzu, ọ dị mkpa ime nnwale denaturation gel RNA iji lelee ma nchapụta dị n'etiti 28S na 18S RNA bụ mmekọrịta okpukpu abụọ.Mgbe nke atọ band 5S pụtara, ọ pụtara na RNA amalitela iweda, ewezuga invertebrates.

Data maka ntule ogo RNA: Na mgbakwunye na ule ndị a dị n'elu, enwekwara ụfọdụ ule ngwa ngwa dị elu karịa n'ihe gbasara iguzosi ike n'ezi ihe RNA, dị ka ule nguzosi ike nke RQI nke Experion akpaaka electrophoresis, nke nwere ike ịchọpụta ma RNA ewedara n'ihu na-adịghị ahụ anya.

N'ime nyocha sayensị, PCR fluorescent quantitative bụ ntụnyere n'etiti mkpụrụ ndụ ihe ezubere iche na mkpụrụ ndụ nrụtụ aka nke ime.Ya mere, na usoro nke RNA sample nchekwa, RNA mmịpụta, wdg, isi ihe mgbaru ọsọ bụ ịhụ na iguzosi ike n'ezi nke RNA.

Kedu ka iguzosi ike n'ezi ihe nke RNA si emetụta nguzozi n'etiti mkpụrụ ndụ ebumnuche yana mkpụrụ ndụ ihe nrụtụ aka dị n'ime nwere ike ịghọta ngwa ngwa site na foto dị n'okpuru.Mmebi ga-eduga na mkpụrụ ndụ ihe nketa ezughị oke, ma ọ bụ ezughị oke nke mkpụrụ ndụ ihe nleba anya n'ime ma ọ bụ ezughị oke nke mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ, ọ ga-enwe mmetụta dị ukwuu na data ahụ.

Eserese eserese nke mkpụrụ ndụ ebumnuche na mkpụrụ ndụ ntụaka, agaghị abụ eziokwu

Nnwale mgbochi (ma a na-ebelata uru CT n'okpuru ntinye dị elu ma ọ bụ dị ala ma ọ bụ ọnọdụ ndị ọzọ)

N'iji ọnụ ọgụgụ a dịka ọmụmaatụ, ụkpụrụ Ct nke akụkụ ise ahụ bụ ndị a.Nkesa nke ụkpụrụ CT dị n'etiti akụkụ ndị ahụ na-adịghị mma, na ụkpụrụ Ct na-egbu oge n'okpuru oke dị elu na nke dị ala, nke bụ ihe mgbochi PCR.

Isi ihe: N'ime usoro mmịpụta RNA, anyị kwesịrị ịhapụ echiche na-ezighi ezi wee guzobe ndị ziri ezi.

Echiche na-ezighi ezi bụ: mmịpụta RNA na-achụso mkpụrụ, na-eche na ka ọnụọgụ RNA nwetara buru ibu, ka mma.N'ezie, mgbe anyị na-eme quantification, ọ bụrụ na ọnụ ọgụgụ nke mkpụrụ ndụ ihe nketa adịghị nnukwu, anyị adịghị mkpa nke ukwuu RNA.Ọnụ ego RNA ị na-ewepụta karịrị nke ezuru.

Echiche ziri ezi bụ:Mwepụta RNA kwesịrị ịchụso ịdị ọcha, iguzosi ike n'ezi ihe na nkwekọ.Ịdị ọcha nwere ike hụ na egbochighị ntụgharị ntụgharị na-esote yana DNA agaghị emetụta data ahụ.Iguzosi ike n'ezi ihe na-eme ka nguzozi nke usoro ebumnuche na ntụnyere ime.Nkwenye na-eme ka a na-ebunye nlele kwụsiri ike.

MIQE (4) - ntụgharị ntụgharị
Echiche na-ezighi ezi: ịchụso olu nlele dị elu.
Echiche ziri ezi: Na-agbaso nkwụsi ike (nkwụsi ike), n'agbanyeghị oke RNA juru, arụmọrụ nke ntụgharị ntụgharị na-anọgide na-agbanwe agbanwe, na-ahụ na ọdịiche dị na cDNA nwere ike igosi ọdịiche dị na mRNA.
Anyị na-eji eserese schematic kọwaa usoro a:

Eserese atụmatụ nke nrụpụta ntụgharị ntụgharị, abụla eziokwu
Nke mbụ, anyị kwesịrị ịghọta ọdịiche dị n'etiti usoro ntụgharị ntụgharị na usoro PCR.PCR na-enweta ọtụtụ usoro ikpo ọkụ na mgbakasị ahụ, na iberibe ebumnuche na-eto nke ukwuu;ebe ntụgharị ntụgharị enweghị usoro a, anyị nwere ike iche na ntụgharị ntụgharị bụ n'ezie otu na otu N'oge usoro mmegharị ahụ, dịka ọtụtụ iberibe RNA.

dị ka enwere ike nweta ọtụtụ iberibe ozi cDNA, a ga-aghọta ya ugbu a, n'ihi na e degharịala ibe n'iberibe nnukwu na obere, na ọ gaghị ekwe omume ilekwasị anya n'otu iberibe.Na n'ihi na ọnụọgụ RNA dị ntakịrị, ọnụọgụ cDNA enwetara dịkwa ntakịrị, n'adịghị ka PCR, nke nwere mmetụta mmụba, yabụ na ọ gaghị ekwe omume ịchọpụta.

Nsonaazụ cDNA electrophoresis
Nke abuo, n'ezie, a na-eme ntụgharị ntụgharị n'otu n'otu, mana ọ nweghị transcriptase nke ụlọ ọrụ ọ bụla nwere ike nweta nsonaazụ a.N'ụzọ bụ isi, arụmọrụ nke ọtụtụ reverse transcriptases na-awagharị n'etiti 30-50%.Ọ bụrụ na nke a bụ ikpe, ọ ga-akara anyị mma ịnwe arụmọrụ ntụgharị ntụgharị kwụsiri ike, nke bụ ihe anyị chọrọ ịhụ na ọnụ ọgụgụ a: 3 RNA na-enweta cDNA 2, 6 RNA na-enweta cDNA 4, yabụ n'agbanyeghị ụdị ihe atụnyere, arụmọrụ ntụgharị ntụgharị kwụsiri ike.Anyị achọghị ịhụ ọnọdụ ebe arụmọrụ ntụgharị ntụgharị na-akwụsighị ike yana igbochi itinye uche dị elu.

Yabụ, kedu ka ị ga-esi chọpụta ma arụmọrụ ntụgharị ntụgharị ahụ kwụsiri ike?Usoro a dị nnọọ mfe, naanị ihe ị ga-eme bụ nyocha ntụnyere: otu bụ ịtụgharị ederede na cDNA ka emechara dilution nke RNA ugboro abụọ, nke ọzọ bụ ime dilution ugboro abụọ mgbe ịtụgharịghachi na cDNA, wee mee qPCR iji hụ mkpọda enwetara Ọ na-agbanwe agbanwe.Dịka nwa akwụkwọ kacha elu, ị kwesịrị ịghọta ya na sekọnd.Dị ka egosiri n'okpuru:

Dilution nke RNA na cDNA iji nwalee ma arụmọrụ nke ntụgharị ntụgharị kwụsiri ike
Weghachite transcriptase na ngwa
Kedu ka PCR zuru oke nwere ike isi nweta transcriptase na ngwa dị mma.A na-ekewa reverse transcriptase ụzọ abụọ dịka isi mmalite si dị, AMV ma ọ bụM-MLV, na arụmọrụ ha bụ otu ihe ahụ egosiri na tebụl.

Ọrụ RNase H
RNase H bụ Ribonuclease H, aha Chinese bụ ribonuclease H, nke bụ endoribonuclease nke nwere ike hydrolyze RNA kpọmkwem na DNA-RNA ngwakọ yinye.RNase H enweghị ike ịmegharị njikọ phosphodiester na DNA ma ọ bụ RNA nwere otu eriri ma ọ bụ RNA, ya bụ, ọ nweghị ike igbari DNA ma ọ bụ RNA nwere eriri abụọ.A na-ejikarị eme ihe na njikọ nke eriri nke abụọ nke cDNA.

Ọ bụ ihe ịtụnanya.Anyị na-ekwu na reverse transcriptase nwere ọrụ RNase H, ọ bụghị na reverse transcriptase nwere RNase H, ma ọ nwere ike ọ gaghị ekwe omume ikewapụ RNase H na reverse transcriptase, ikekwe n'ihi nhazi nke ụfọdụ otu na ntụgharị transcriptase na-akpata ọrụ a.

Ya mere, n'agbanyeghị na elu reverse transcription arụmọrụ nke AMV, ya RNase H ọrụ na-ebelata mkpụrụ nke cDNA.N'ezie, ndị na-emepụta reagent na-ebuli ngwaahịa ha mgbe niile iji kpochapụ ọrụ RNase H na reverse transcriptase dị ka o kwere mee iji mụbaa mkpụrụ nke cDNA.
Okpomọkụ na-egbu egbu

Ọdịdị nke abụọ nke RNA na okpomọkụ dị iche iche
Hụ onyonyo dị n'elu maka nhazi nke abụọ nke RNA na ọnọdụ okpomọkụ dị iche iche, wee jiri ngwa ntanetị mFold chọpụta nhazi nke abụọ nke iberibe ebumnuche n'okpuru ọnọdụ okpomọkụ na ntinye nnu.Na 55 Celsius C, usoro nke abụọ nke RNA ka dị mgbagwoju anya, ntụgharị transcriptase enweghị ike ịrụ ọrụ, na usoro nke abụọ enweghị ike idozi kpamkpam ruo 65 Celsius, ebe okpomọkụ kachasị mma nke AMV na M-MLV dị ala karịa okpomọkụ a.
ihe a ga-eme?Usoro nke abụọ bụ njikọta nke template n'onwe ya, nke na-eduga n'asọmpi siri ike n'etiti primer na reverse transcriptase na template, na-ebute nsogbu dị iche iche dị ka obere E na enweghị ike ikwughachi.

ihe a ga-eme?Naanị welie okpomọkụ na-ekpo ọkụ ka o kwere mee.

Ọtụtụ ndị na-emepụta reagent na-emeziwanye transcriptase ha site na injinịa mkpụrụ ndụ ihe nketa.Ụfọdụ na-abawanye okpomọkụ mmeghachi omume, dị ka Jifan na Aidelai, na ụfọdụ na-ewepụ ndị na-arụ ọrụ nke enzyme RNase H iji melite mmekọrịta dị n'etiti enzyme na RNA template.Mmekọrịta dị elu nwere ike ịsọpụrụ usoro nke abụọ wee gụọ ya nke ọma, ma kwalitekwa arụmọrụ nke ntụgharị ntụgharị.
Isi ihe: Ntugharị ntụgharị dị mkpa karịa ịchụso nkwụsi ike nke nrụpụta ntụgharị ntụgharị (enzymes agaghị abụ naanị nke ọma kamakwa ọ kwụsiri ike), karịa ọnụọgụ nlele eburu, ma ọ bụrụ na ọ bụghị PCR nke fluorescent buru ibu karị, ọ gaghị ekwe omume ma ọlị.Ọtụtụ cDNA.
Ndị na-emepụta ihe dị iche iche emewokwa mgbalị ụfọdụ n'ịchụso nkwụsi ike.Dịka ọmụmaatụ, ọtụtụ ụlọ ọrụ ugbu a achịkọtala ntụgharị ntụgharị dị ka ngwa ọkọlọtọ maka ọrịre, nke bụ nhọrọ dị mma.
Dịka ọmụmaatụ, ngwa Foregene's RT Easy Series:

RT Easy I (Master premix maka eriri mbụ cDNA njikọ ngwa)

MIQE (5) - ozi mkpụrụ ndụ ebumnuche

Ọnụ ọgụgụ dị n'elu na-akọwa
1. Enwere ike ịchọpụta ma mkpụrụ ndụ ihe nketa a dị irè maka nnwale ugboro ugboro site na nnwale ugboro ugboro.
2. Gene ID, ị maara.
3. Gene ogologo, ngụkọta ogologo nke lekwasịrị mkpụrụ ndụ ihe nketa bụ maa enweghị nsogbu.Mgbe ị na-emepụta primers, hụ na ogologo nke amplicon dị n'etiti 80-200bp iji hụ na ọ ga-arụ ọrụ nke ọma.
4. Ozi ntụnyere nke usoro nke usoro mgbawa, a ga-atụnyere mkpụrụ ndụ ihe ezubere iche na genebank iji gbochie mmụba na-abụghị nke akọwapụtara.
5. Ọnụnọ nke pseudogenes.Pseudogene bụ usoro DNA nke yiri mkpụrụ ndụ nkịtị mana ọ na-efunahụ ọrụ ya.Ọ na-adịkarị na ezinụlọ multi-gene nke eukaryotes.A na-anọchi anya ya na ψ.Ọ bụ DNA mkpụrụ ndụ ihe nketa nke na-adịghị arụ ọrụ na genome nke yiri nnọọ usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa., a naghị edekarị ya, ọ nweghịkwa ihe ọ pụtara n'ụzọ doro anya.
6. Ọnọdụ nke primers ikwu exons na introns.N'afọ ndị mbụ, mgbe anyị doziri nsogbu nke mmetọ DNA, anyị na-elebakarị anya na ọnọdụ nke primers, exons, na introns, ma na-atụlekarị ịmepụta primers gafee introns iji zere mmụba DNA.Biko lee foto dị n'okpuru: ojii na-anọchite anya introns, blues dị iche iche na-anọchi anya exons, pink na-anọchite anya primers nkịtị, na uhie na-egbuke egbuke na-anọchi anya primers intron-span.

Schematic, ọ bụghị eziokwu
Kedu atụmatụ zuru oke nke a yiri, mana n'eziokwu, n'ọtụtụ ọnọdụ, trans-intron primers adịghị eme anwansi dị ka e chere, ha ga-emekwa ka mmụba na-enweghị isi.Ya mere, ụzọ kacha mma isi gbochie DNA mmetọ bụ iwepụ DNA kpamkpam.
7. amụma amụma.Iji ihe atụ a ọzọ, jiri ngwa mFold dị n'ịntanetị iji chọpụta nhazi nke abụọ nke mpekere ebumnuche n'otu okpomoku na ntinye nnu.

Ọdịdị nke abụọ nke RNA na okpomọkụ dị iche iche
Ihe owuwu nke abụọ bụ njikọta nke template n'onwe ya, nke ga-eduga n'asọmpi siri ike n'etiti primer na template pairing, na ohere nke njide primer dị ntakịrị, na-ebute nsogbu dị iche iche dị ka obere E na enweghị ike ikwughachi.Site na amụma ngwanrọ, ọ bụrụ na enweghị nsogbu nhazi nke abụọ, nke ahụ ga-adị mma.Ọ bụrụ na ọ dị, isiokwu anyị na-esochi ga-atụle kpọmkwem otú e si edozi nsogbu a.

MIQE (6)-qPCR Oligonucleotides

Maka PCR fluorescent quantitative, ihe mbụ ị na-alụ kwa ụbọchị bụ mmịpụta RNA, ihe nke abụọ nwere ike ịbụ nhazi nke mbụ.
Nke mbụ, anyị ka na-elele iwu gbasara imewe nke mbụ dị ka ndetu MIQE si dị.Ọ dị mfe na ndị scumbags nwere ike ịchị ọchị, anyị nwere ike mechaa ya n'otu ahịrịokwu: chọpụta usoro na ọnọdụ nke nyocha primer na usoro mgbanwe.Maka usoro nchacha nke mbụ, nchịkọta primer dị ọnụ ala ugbu a, qPCR kwesịrị ekwesị maka PAGE na n'elu usoro nchacha, na ozi nke ngwa ngwa adịghị mkpa.Ọtụtụ ndị mmadụ na-eme primers ruo ọtụtụ iri afọ ma amaghị na synthesizer bụ ABI3900.
Banyere ụkpụrụ nke primer imewe, ị na-adịghị na-n'isi ha site rote, n'ihi na ọtụtụ primer imewe software ma ọ bụ online ngwá ọrụ nwere ike na-elekọta nsogbu ndị a (na-atụ aro online ngwá ọrụ primer3.ut.ee/), na 99.999% nke primer imewe na-adịghị eme ya aka Lee, onye edemede mgbe ụfọdụ na-emepụta ọtụtụ narị primers otu ụbọchị, ọ bụrụ na ị na-agụ otu otu, ọ ga-aghọ cross-ey.
Naanị lelee isi ihe ndị a ka emechara primers:
1. Nhazi primers nso na njedebe 3 ': N'ihe banyere iji oligo dT primers maka cDNA mbụ-strand synthesis, n'ịtụle ntụgharị ntụgharị ntụgharị na iguzosi ike n'ezi ihe RNA, a ga-emepụta primers ndị a haziri nso na njedebe 3' iji melite arụmọrụ nkwalite.Jiri eserese kọwaa otu a (ọ nweghị ụzọ isi ghọta nke a):

Kedu ihe kpatara eji hazie primers nso na njedebe 3′, ọ gaghị abụ eziokwu
2. Uru TM: Ọnụ ego Tm dị na 55-65 ° C (n'ihi na ọrụ exonuclease kachasị elu na 60 ° C), na ọdịnaya GC dị na 40% -60%.
3. Mgbawa: Iji zere mmụba nke genome na-abụghị nke akọwapụtara, a ga-eji Blast mee nkwenye mgbakwunye.

MIQE(7)-qPCR usoro

1. qPCR ngwa
Dị ka ihe ndị a chọrọ n'aka MIQE, anyị ga-akọwa n'ụzọ doro anya zuru ezu mmeghachi omume ọnọdụ na isiokwu, gụnyere nhazi nke PCR mmeghachi omume usoro, kedu kit na-eji, onye na-emeputa, otú nnukwu bụ mmeghachi omume usoro, ma a na-eji agba agba ma ọ bụ usoro nyocha usoro, PCR ntọala ntọala.Ndị ọkwọ ụgbọ ala ochie ga-achọpụta na ọ bụrụhaala na ahọpụtara ngwa ahụ, a na-ekpebi ozi ndị dị n'elu.
Ka ọ dị ugbu a, imepụta na mmepụta nke ngwa PCR nke fluorescent quantitative bụ teknụzụ tozuru oke.Ọ bụrụhaala na ị naghị ahọrọ ndị na-emepụta ihe na-adịghị mma, ohere nke nsogbu adịghị elu, mana anyị ka chọrọ ịkọrọ gị isi ihe ole na ole:
Enzyme Taq na-ekpo ọkụ:Akụkụ kachasị mkpa nke PCR bụ enzyme Taq na-ekpo ọkụ.Enzyme mmalite na-ekpo ọkụ n'ahịa na-ekewa n'ime ụdị abụọ, otu bụ enzyme na-ekpo ọkụ na-ekpo ọkụ na-agbanwe agbanwe (ị nwere ike iche ya dị ka ntinye paraffin), nke ọzọ bụ enzyme na-ekpo ọkụ maka mgbanwe mgbochi (antigen-antibody binding).Mgbanwe kemịkalụ bụ ụzọ mmalite nke enzymes na-ekpo ọkụ.Mgbe ụfọdụ okpomọkụ ruru, enzyme ahụ ga-ahapụ ọrụ ya.Enzyme mmalite na-ekpo ọkụ emezigharị nke mgbochi mmadụ na-eji ụzọ ndu egbochi ọrụ nke enzyme ahụ.Mgbe ụfọdụ okpomọkụ ruru, a ga-ewepụ ihe mgbochi ahụ ma mee ka ọ ghara ịrụ ọrụ dị ka protein, a ga-ewebata ọrụ enzyme ahụ.

Otú ọ dị, gịnị bụ uru nke a?Nke a bụ ikpe, ntọhapụ nke enzymes ndị na-emegide mmadụ na-agbanwe ngwa ngwa karịa nke enzymes emezigharịrị kemịkalụ, yabụ n'ihe gbasara uche, enzymes ndị na-agbanwe agbanwe nwere ntakịrị uru, nke mere na enweghị isi ọ nweghị enzymes gbanwere kemịkal na ngwa ahịa ahụ.Ọ bụrụ na e nwere, mgbe ahụ, a na-emepụta nkà na ụzụ na-anọgidesi ike na oge nke puku afọ.
Ntinye uche nke magnesium ion:Ntinye uche nke Magnesium ion dị ezigbo mkpa na mmeghachi omume PCR.Ntinye uche nke ion magnesium kwesịrị ekwesị nwere ike ịkwalite ntọhapụ nke ọrụ enzyme Taq.Ọ bụrụ na ịta ahụhụ dị oke ala, ọrụ enzyme ga-ebelata nke ukwuu;ọ bụrụ na ịta ahụhụ dị oke elu, a ga-eme ka mmụba na-enweghị isi nke enzyme-catalyzed.Ntinye uche nke ion magnesium ga-emetụta nkwụsị nke primers, okpomọkụ na-agbaze nke ndebiri na ngwaahịa PCR, si otú ahụ na-emetụta mkpụrụ nke iberibe iberibe.A na-achịkwa ntinye nke ion magnesium na 25mM.N'ezie, maka ngwa dị mma, a ghaghị ịchịkwa ntinye nke ion magnesium nke ọma.Ụfọdụ ndị ahịa na-agbakwunye onye na-ahụ maka chelating magnesium ion na reagent, nke nwere ike nweta mmetụta nke ngbanwe akpaka nke ntinye magnesium ion.
Ntinye ihe nchacha fluorescent:Fluorescent dye, nke bụ SYBR Green anyị na-ejikarị eme ihe, tumadi na-emepụta fluorescence site na ijikọta obere oghere nke DNA nke nwere eriri abụọ, n'ihi na njide nke agba na DNA nke nwere eriri abụọ abụghị nke a kapịrị ọnụ, ya bụ na ọ bụrụhaala na DNA jikọtara ya na ya, fluorescence template nwere ike ime na usoro DNA na-emepụta ihe na-emepụta ihe na usoro DNA.
PS: N'ihi ihe ndị nwere mmetụta ọkụ ya, ngwaahịa ndị dị na ahịa na-ejikọta ya na tubes centrifuge opaque (dị ka e gosiri na foto dị n'okpuru).Otú ọ dị, nke a ga-enwe nsogbu.O siri ike ịhụ ma a na-aṅụ mmiri mmiri mgbe a na-enyocha ya.N'akụkụ a, Qingke bụ n'ezie enyi na enyi kacha mma (dị ka egosiri na foto dị n'okpuru ebe a), a na-etinyekwa tube a na-ahụ anya n'ime akpa tin opaque.Mgbe ahụ, tinye ya n'ime akpa tin, na-eburu n'uche ịdị mma nke izere ọkụ na nlele.Ị ga-ahọrọ nọmba ngwaahịa ziri ezi.TSE204 bụ ndụ dị oke ọnụ ahịa, nke na-eme ka m chọọ ịkụ ahịhịa.

Nleba anya nke ụcha fluorescent dịkwa oke mkpa.Ọ bụrụ na ịta ahụhụ dị oke ala, mgbaka nkwalite agaghị aga n'ihu na-esote ma ezughị oke;ọ bụrụ na ntinye uche dị oke elu, ọ ga-eme ka nnyonye anya mkpọtụ.Ebe ọ bụ na PCR fluorescent quantitative na-adabere na uru CT, ọ bụrụ na edozighị ntinye nke ihe na-acha fluorescent nke ọma, ebe dị ala dị mma karịa ebe dị elu.N'ezie, ntinye agba agba kwesịrị ekwesị bụ ihe kacha mma.

ROX: A na-eji agba agba ROX emezi maka njehie mgbama fluorescence na-eme nke ọma.Ụfọdụ ndị na-emepụta ngwá ọrụ chọrọ nhazigharị, ebe ndị ọzọ anaghị achọ.Dịka ọmụmaatụ, iji Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR amplification ngwá ọrụ na-achọkarị calibration, gụnyere 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, wdg. Ntuziaka ngwa ngwa n'ozuzu ga-akọwa ya.
Foregene's qPCR Mix nwekwara ROX dye, nke dị mma maka ojiji n'ụdị dị iche iche.

Real Time PCR Kit-Taqman

Ọgwụgwọ njikọ hydrogen adịghị ike: Ngwọta nke njikọ hydrogen adịghị ike bụ ihe dịtụ aka.Ọ dịghị ihe gụrụ akwụkwọ ntuziaka nke ọtụtụ ngwa, ma ọ dịghị nke n'ime ha kwuru okwu a.N'ezie, ọ dị oke mkpa.Ngwakọta ntọala na-adabere na ike nke njikọ hydrogen.Njikọ hydrogen siri ike bụ mmụba nkịtị, na njikọ hydrogen adịghị ike na-eduga na mmụba na-abụghị nke akọwapụtara.Ọ bụrụ na enweghị ike ikpochapụ agbụ hydrogen na-adịghị ike nke ọma, enweghị ike ịgbanahụ nkwalite na-abụghị nke akọwapụtara.N'ime oke nke onye edemede, ọ bụ naanị ụlọ ọrụ ole na ole achọpụtala nsogbu a.Mgbe ịzụrụ ngwa ahụ, ị ​​nwere ike ịtu aka ma ị tụlere ihe ngwọta na nke a maka ngwa ịchọrọ ịhọrọ.

Olu mmeghachi omume: A na-ejikarị usoro 20-50ul eme ihe, na obere mpịakọta nwere ike ịkpata njehie.N'ikwu okwu n'ozuzu, ntuziaka kit ga-akwado iji mpịakọta mmeghachi omume PCR.Adịla akọ ma jiri obere mpịakọta chekwaa ego.ihe mgbaru ọsọ nke.A nwalewo olu nke ndị ahịa na-atụ aro ya, ma ọ nwere ike ịbụ na ha enweghị ike idozi nsogbu nke njehie nke obere mpịakọta kpatara.
2. Onye nrụpụta na nọmba isiokwu nke efere tube
Onye ọ bụla maara ụkpụrụ nke fluorescent quantitative PCR.A na-ebukarị nchịkọta fluorescence site na PCR tube okpu.Mgbe ị na-ahọrọ ihe oriri PCR, ṅaa ntị na isi ihe abụọ: nnyefe ọkụ dị mma na adabara ngwá ọrụ.N'ikwu okwu n'ozuzu, bọọdụ na tubes nke ụdị ndị isi dị mma, mana ị ga-ahọrọ nke ọma n'ihe gbasara mmegharị, ma ọ bụghị na ị gaghị enwe ike iji ngwá ọrụ ahụ.

4. Ihe ọmụma kachasị elu

MIQE (8)-qPCR nkwado
Nke a bụ ihe kacha mkpa nke qPCR!Ọtụtụ ndị dike adaala n'ájá ebe a.N'ezie, ọ ga-ekwe omume na ị nwere chi ọma na mkpụrụ ndụ ihe nketa ị mụrụ dị mfe, yabụ ị na-ese n'elu ọgba ice n'akụkụ ikuku.Ezubere ozi nkwenye nke qPCR iji nwalee ntụkwasị obi nke data ahụ.Anyị depụtara ozi nkwenye dị mkpa dị ka ndị a:

1.Specificity ule
A na-anwale nkọwapụta nke mmụba mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ site na ịlele ma foto electrophoresis bụ otu ìgwè;nkwenye usoro;agbaze agbaze iji hụ ma map kacha elu ọ bụ otu;nkwenye mgbaze enzyme na usoro ndị ọzọ.
N'ebe a, anyị na-elekwasị anya na tọ nyocha nke mmụba na-abụghị nke a kapịrị ọnụ na-eji usoro agbaze agbaze.N'ikwu okwu n'ozuzu, mgbe anyị na-emepụta primers, a chọrọ nha nke mpempe ngwaahịa ahụ ka ọ dị na 80-200bp, nke na-eme ka okpomọkụ na-agbaze nke ngwaahịa PCR 80-85 Celsius C.Ya mere, ọ bụrụ na enwere ọnụ ọgụgụ dị iche iche, a ga-enwerịrị ngwaahịa nkwalite ndị ọzọ na-abụghị nke akọwapụtara;ọ bụrụ na ọnụ ọgụgụ kasị elu na-apụta n'okpuru 80 Celsius, a na-ewerekarị ya dị ka ihe na-emepụta ihe;Ọ bụrụ na ọnụ ọgụgụ kacha elu pụtara n'elu 85 Celsius, a na-ewerekarị ya dị ka mmetọ DNA ma ọ bụ karịa na-enweghị nkọwa nke nnukwu iberibe.
Cheta na: Mgbe ụfọdụ a na-enwe naanị otu ọnụ ọnụ na 80 Celsius.N'oge a, a ghaghị ịgbaso echiche a.O yikarịrị ka nsonaazụ nkwalite ahụ bụ ihe niile na-emepụta ihe.

Usoro mgbaze nkịtị (otu ọnụ ọgụgụ kasị elu na-enweghị nkwalite na-abụghị nke akọwapụtara)

Usoro mgbaze na-enwe nsogbu (nkwalite ọnụ ọgụgụ dị elu na-abụghị nke akọwapụtara)
【Nyocha ikpe】

Enwere ọnụ ọgụgụ kachasị elu, mana dimer primer dị njọ
Usoro mgbaze nke otu-elu na ọnụ ọgụgụ dị n'okpuru nwere ike iduhie anya gị n'ụzọ dị mfe, na-eche na ọ bụ nnwale zuru oke, mana nsonaazụ ya bụ ihe na-ezighi ezi.N'oge a, anyị ga-ele anya na-agbaze okpomọkụ.Okpomọkụ kachasị elu dị n'okpuru 80 Celsius C, nke na-emecha ngwa ngwa-dimer.

Enweghị iberibe ebumnobi, ihe niile na-ebu ụzọ
Ebe a, nwanne m enweghị ike ịkwụsị.Foto dị n'okpuru ebe a bụ foto ejiri ekwentị mkpanaaka zitere m.Reagents ndị o ji mee ihe bụ ụdị ndị a na-ejikarị eme ihe na ụlọ ọrụ ahụ.Ọ gbanwere site na T-prefix ika gaa na T-prefix ọzọ.Echere m na ị chebuola ya.Nkịta ahụ tikuru m mkpu, sị: “Ihe reagent e ji mee ihe na foto mbụ dị nnọọ mma nke ukwuu, ọnụ ọgụgụ kasị elu alụbeghịkwa di.Ka emechara, mgbe ijiri reagent ị tụrụ aro, ọ ga-adị ka foto nke abụọ, yana ọnụ ọnụ ọnụ.I mewo ka obi jọọ m njọ."
Kewaa eserese abụọ ahụ.N'ileghachi anya na mbụ, otu nwere otu ọnụ ọgụgụ kasị elu, nke ọzọ nwere ọnụ ọgụgụ kasị elu okpukpu abụọ.Ihe nzuzu, otu ọnụ ọgụgụ kacha mma n'ezie.Nke ahụ ọ bụ eziokwu?
Nke ka njọ karịa Dou E, ọ bụrụ na m tinye foto abụọ na foto dị n'okpuru ebe a, ị ga-aghọta ozugbo.N'ezie, ụdị foto a na-eme ka anyị kpọnwụrụ ngwa ngwa.Mgbe anyị nyochachara nke ọma, anyị chọpụtara na: ọnụ ọgụgụ kasị elu nke ọnụ ọgụgụ mbụ dị na 75 Celsius C, nke bụ ihe na-emepụta ihe zuru oke;ọnụ ọgụgụ kasị elu nke ọnụ ọgụgụ nke abụọ na-egosi na 75 ° C na 82 Celsius C, ma ọ dịkarịa ala enwere ngwaahịa ahụ pụtara.

Foto nke nzaghachi sitere n'aka ụmụ akwụkwọ
Ya mere, nsogbu bụ isi abụghị nsogbu nke reagents, ma nsogbu nke primer imewe.N'otu oge ahụ, ọ na-egosikwa na ụfọdụ nnukwu ụdị abụghị nke ígwè, ọ na-egosipụtakwa ihe nwanne m nwoke kwuru na mbụ: Ọ bụghị akara reagent na-akwado isiokwu gị.Ọ bụ akụkọ gị nke kwalitere akara nke reagents.Cheedị echiche, ọ bụrụ na scumbag agbanweghị reagents, a ga-eziga data na-ezighi ezi na akwụkwọ akụkọ, na ihe ga-eme ga-abụ ọdachi.
2. Ct uru nke njikwa oghere
Akọwala, ọ bụrụ na njikwa oghere nwere uru Ct, ọ bụghị mmetọ?Agbanyeghị, ị ka kwesịrị ịghọta njikwa oghere nwere uru Ct.Ọ bụrụ na ọ bụ NTC, ọ pụtara na enwere DNA mba ọzọ dị ka mmetọ reagent.Ọ bụrụ na ọ bụ NRT, ọ pụtara na RNA ahụ ewepụtara nwere nje DNA.
3. Usoro ọkọlọtọ
Gụnyere usoro mkpọda na mgbako, enwere ike gbakọọ arụmọrụ PCR site na usoro.Nnwale zuru oke chọrọ mkpọda nke ọkọlọtọ ọkọlọtọ ka ọ bịaruo 3.32, yana R² ịbịaru nso 0.9999.
4. Linear ike nso
Usoro dị ike nke mmeghachi omume bụ ahịrị.Dị ka ndebiri ejiri mepụta usoro ọkọlọtọ, oke ike kwesịrị ịgụnye opekata mpe 5 gradients, ma ṅaa ntị na mgbanwe nke ụkpụrụ Ct na gradients dị elu na gradients dị ala.
5. Nchọpụta ziri ezi
Mgbanwe na nsonaazụ qPCR, ya bụ, mmeghari na-adịghị mma, ya bụ, nke na-adịghị mma, na-ebute ọtụtụ ihe, gụnyere okpomọkụ, itinye uche, na ọrụ.Nzizi qPCR n'ozuzu na-aghọ obere njikwa ka ọnụọgụ nnomi na-ebelata.Dị ka ọ dị n'ime mgbanwe nnwale, mgbanwe teknụzụ a kwesịrị ịdị iche na mgbanwe ndu, na ihe ngbanwe nke ndu nwere ike kwupụta esemokwu ndekọ aha ozugbo na nsonaazụ qPCR n'etiti otu ma ọ bụ ọgwụgwọ.Karịsịa maka nyocha diagnostic, nke kacha mma n'etiti-nyocha nke ọma (repeatability) n'ofe saịtị na ndị ọrụ ga-akọrịrị.
6. Nchọpụta arụmọrụ na LOD (na multiplex qPCR)
LOD bụ mkpokọta kacha ala nke 95% nke ihe nlele dị mma achọpụtara.N'ikwu ya n'ụzọ ọzọ, ntinye uche nke LOD dị n'ime usoro nke mkpụrụ ndụ ihe nketa echere ekwesịghị ịfe 5% nke mmeghachi omume dara ada.Mgbe ị na-eme multiplex qPCR analysis, karịsịa maka n'out oge nchọpụta nke isi mutations ma ọ bụ polymorphisms, multiplex qPCR kwesịrị inye ihe àmà na izi ezi nke otutu lekwasịrị iberibe adịghị emebi n'ime otu tube, otutu nchọpụta na otu tube nchọpụta arụmọrụ na LOD kwesịrị ịbụ otu.Karịsịa mgbe mkpụrụ ndụ ihe nketa lekwasịrị anya dị elu na mkpụrụ ndụ ihe nketa dị ala na-abawanye n'otu oge, nsogbu a ga-akpachara anya.
Nsogbu na ngwọtaN'ikwu okwu n'ozuzu, nsogbu ndị a na-ezutekarị na qPCR debugging na-elekwasị anya na akụkụ ndị a:
· nkwalite enweghị nkọwa
Nhọrọ siri ike nke ntinye uche nke primer na nsogbu na primer-dimers
Okpomọkụ na-ekpo ọkụ ezighi ezi
Ihe owuwu nke abụọ na-emetụta arụmọrụ nkwalite
nkwalite enweghị nkọwa
nkwalite na-abụghị nke akọwapụtaraemee , a na-atụlekarị ma nhazi primer adịghị mma, ma ọ bụrụ na ị naghị eme ngwa ngwa ịgbanwe primers, ị nwere ike ịnwale ụzọ ndị a na mbụ (a na-ejikọta ụkpụrụ ahụ):
· Mụbaa okpomọkụ na-ekpo ọkụ - gbalịa mee ka njikọ hydrogen na-adịghị ike na-enweghị ike ịnọgide na-enwe;
· Mkpirisi mgbakasị ahụ na oge elongation - belata ohere nke njikọ hydrogen na-adịghị ike;
· Belata ntinye uche nke mbụ - belata ohere nke ijikọta primers na-abaghị uru na mpaghara ndị na-abụghị ebumnuche;
Obere nkwalite arụmọrụ
Ọnọdụ dị iche na mmụba na-abụghị nke a kapịrị ọnụ - arụmọrụ nkwalite dị ala, yana usoro ndị a ga-eme maka nrụpụta nkwalite dị ala bụ ihe dị iche:
· Na-agbatị oge nkwụsịtụ na elongation;
· Gbanwee na PCR nzọụkwụ atọ ma belata okpomọkụ na-ekpo ọkụ;
· Mee ka ntinye uche nke mbụ;
Ps: Ọtụtụ ndị gụsịrị akwụkwọ na ụmụ akwụkwọ a mụrụ na 90s adịghị njikere ịmụ otú debug nnwale, na-atụ anya na kit nwere ike kpamkpam dozie nsogbu ahụ (ma ọ bụrụ na ị chọrọ ịga a reagent ụlọ ọrụ na-eme nnyocha na mmepe mgbe gụsịrị akwụkwọ), n'ezie, na reagent emepụta na-echekwa otú a, m na-atụ anya na ọ bụ onye nzuzu Enwere ike iji ya mgbe ị nwetara ya, ya mere, reagent nke ndị na-emepụta ihe na-adịghị ike na-edozi nsogbu na-adịghị ike, gụnyere ndị na-emepụta ihe na-adịghị ike na amplification. H-bond absorption ihe.Iji dozie nsogbu ahụ n'ụzọ dị mfe, ndị nzuzu ka ga-agụ mmeghe nke ụlọ ọrụ reagent iji hụ ma ọ dị ihe na-eme ka agbụ hydrogen na-adịghị ike.
Nhọrọ siri ike nke ntinye uche nke primer na nsogbu na primer-dimers
Usoro 1: N'ikwu okwu n'ozuzu, ntuziaka kit maka qPCR akwadoro sistemu yana ntinye ntinye nke akwadoro.
Usoro 2: Debugging site na ịtọ ntọala gradient nke mbụ.Ezuru foto dị n'okpuru n'aka ụlọ ọrụ iji gosi ya.Ọnụ ọgụgụ dị n'okpuru na-egosi nsonaazụ fluorescence quantitative mere na gradients atọ nke primer (100nM, 250nM, 500nM) na gradients anọ template (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Edere uru Ct nke nsonaazụ nnwale dịka ndị a:

Nhọrọ itinye uche nke Primer Mee ka itinye uche primer ọ bụla n'ime ahịrị dị ka ndị a:

Nhọrọ nke ntinye uche nke primer doro anya, njikọ njikọ nke ntinye uche nke 100nM na 250nM ka mma, na njikọ njikọ nke ntinye uche nke 500nM adịghị mma.Na 100nM na 250nM, uru Ct nke 250nM dị ntakịrị, ya mere ntinye kachasị mma bụ 250nM.N'ozuzu, a na-ahụ primer-dimer siri ike na mgbaze agbaze.Gịnị ma ọ bụrụ na ihe ndị a haziri ahazi enweghị ike izere primer-dimers?
Usoro 3: Belata ọnụ ọgụgụ nke primers ma mee ka okpomọkụ na-ekpo ọkụ (ọ dịghị mkpa ịkọwa).
Uru pụtara ìhè nke annealing okpomọkụ bụ 60 Celsius C.Ọ bụrụ na ịmaghị n'aka, otu esi ahọrọ okpomọkụ kacha mma na-egbu mgbu?Azịza ya bụ otu ihe ahụ dị ka nhọrọ nke ntinye uche nke primer -ule gradient.Were foto sitere na ụlọ ọrụ Bio-rad iji gosi nsogbu ahụ.Maka mmụba nke ụfọdụ iberibe ebumnuche, debe gradients okpomọkụ asatọ, nke ọ bụla nwere ugboro atọ, na usoro nkwalite enwetara bụ nke a:

nhọrọ okpomọkụ na-eme ka ọ ghara ime ka ọ ghara ịdị:
· 70 ° C, 69 ° C-N'ụzọ bụ isi, a pụghị ijikọta primers, ya mere ọ dịghị mmụba.
· 67.3 Celsius C - Enwere ntakịrị mmụba na mmalite, na uru Ct dị ntakịrị.
· 64.5°C——Uru Ct na-ebelata.
Na 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, na 55.0°C, ụkpụrụ Ct na-achọsi ike ka ọ kwụsie ike, mana ụkpụrụ fluorescence ikpeazụ dị iche.
Kedu ka esi ahọrọ?Ụkpụrụ: Ụkpụrụ mbụ bụ uru Ct dị elu.Maka otu uru Ct ahụ, họrọ okpomoku na-ekpo ọkụ dị elu ka ịzena mbelata na mmụba na-abụghị nke akọwapụtara.Ọ bụ ezie na enwere uru fluorescence dị elu na 55 Celsius, enwere ike ịnwe dimers ma ọ bụ mmụba na-abụghị nke akọwapụtara na ya.
Ma ọ bụrụ na ị maara ihe dị ka gị, ị ga-eche n'ezie: N'ikwu okwu n'ụzọ ezi uche dị na ya, ọ bụrụ na mmeghachi omume PCR dị nnọọ kpọmkwem, ọ bụrụhaala na ntinye uche nke primer karịrị ihe kacha nta a chọrọ, isi ihe dị elu na nke dị ala ekwesịghị inwe mmetụta ọ bụla, dị ka fluorescent agba na dNTP.N'ezie, ọ bụrụhaala na a na-emeziwanye okpomọkụ na-ekpo ọkụ nke ọma, a ga-ebelata mmetụta nke itinye uche nke primer na uru Ct.

A na-emeziwanye ọnọdụ okpomọkụ nke ọma, a ga-ebelatakwa mmetụta nke itinye uche na CT
Nhazi nke abụọ na-emetụta arụmọrụ nkwalite
Ka anyị were foto si na Bio-rad gosi nsogbu ahụ.Ọ na-emepụtakwa gradient okpomọkụ iji bulie mkpụrụ ndụ ihe nketa nwere nhazi nke abụọ.

Ọdịdị nke abụọ na-apụta
Enwere ike ịhụ na ka gradient okpomọkụ na-ebelata, ngwaahịa na-amalite ịpụta na uru Ct na-aga n'ihu, na-erute uru kacha nta na 60.7 ° C, mgbe ahụ ka gradient okpomọkụ na-ebelata, uru Ct na-abawanye.N'aka nke ọzọ, dị ka okpomọkụ na-abawanye, usoro nke abụọ na-emepe na arụmọrụ mmụba na-abawanye.Mgbe ị rutere n'otu ọnọdụ okpomọkụ, ịba ụba okpomọkụ enweghị ike imeziwanye arụmọrụ nkwalite.N'ihi na enweghị ike ijikọta primers n'oge a.Ya mere,chọọ ọnọdụ okpomọkụ na uru Ct kacha ala, nke kacha mma okpomọkụ maka amplifying nke abụọ Ọdịdị template!N'ezie, ndị nzuzu maara ihe aghaghị ịmara na ọ bụrụ na ọ dịghị mkpa, ọ ka mma ịgbanwe primers ma zere mpaghara nhazi nke abụọ.
5. Ngwa ọkwa
MIQE—Ntụle data

A na-enye nyocha data nke ọma site na ngwa PCR nke fluorescent quantitative.N'isiokwu gara aga, a na-arụ ọtụtụ ọrụ nyocha data, dị ka njikwa oghere, nke a kọwara na nhazi nke nnwale ahụ.A kọwapụtala mkpụrụ ndụ ihe nketa dị n'ime, ọnụọgụ ugboro, wdg., ebe a anyị na-akọwakarị ngwa nke qPCR.
A na-eji qPCR eme ihe n'ọtụtụ ebe, yana nyocha nnwale na nchọpụta nucleic acid bụ ihe ndapụta a na-ejikarị eme ihe.
zuru oke quantification
Log (ntụkwasị uche mbụ) nwere njikọ kwụ ọtọ na ọnụọgụ okirikiri.Enwere ike ịdọrọ eriri ọkọlọtọ site na ọkọlọtọ nwere nọmba nnomi mbụ amaara, ya bụ, enwere ike nweta njikọ ahịrị nke mmeghachi omume mmụba.Dị ka uru Ct nke ihe nlele ahụ si dị, enwere ike ịgbakọ ntinye dị na nlele ahụ.Ọnụ ego ndebiri iji tinye.

Ụzọ ngụkọ ọnụọgụgụ zuru oke
Ntụle zuru oke ga-adabererịrị na mgbanaka ọkọlọtọ.Iji mee eriri ọkọlọtọ, achọrọ ọkọlọtọ.Ọtụtụ mgbe, ọkọlọtọ bụ plasmid enwetara site na ijikọ mkpụrụ ndụ ihe mgbaru ọsọ.Gịnị mere o ji bụrụ plasmid?N'ihi na DNA plasmid okirikiri bụ ihe kwụsiri ike.Ghichaa ngwaahịa ọkọlọtọ na 5 ruo 6 gradients dị ka ọnụọgụ abụọ (dilution 10), ma ṅaa ntị na otu mgbe ị na-agbaze.Ka ọnụ ahịa Ct daa n'etiti 15-30.

Nkwadebe ọkọlọtọ
N'otu oge ahụ, ihe nlele a ga-anwale kwesịkwara ịgbanye ya (cheta ihe dilution), uru Ct kwesịkwara ịdaba n'etiti 15-30.A na-etinye ngwaahịa ọkọlọtọ + ihe nlele a ga-anwale na igwe ọnụ.Mgbe agbachara ọsọ ahụ, a na-eji ihe eji eme ihe na-eme ka ọkpụkpụ ọkọlọtọ mee ihe, na ihe nlele ndị a ga-anwale na-ebute n'ime usoro ọkọlọtọ iji gbakọọ mkpokọta.
Ịba ọcha n'anya B nje HBV bụ ihe a na-ahụkarị, nke nwere ike gbakọọ nọmba nje virus na 1ml nke ọbara.
Ngụkọta ọnụọgụ nnomi
Nleba anya nke a ga-anwale (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × ihe dilution
Ihe atụ arọ molekụla = ọnụọgụ ntọala × 324
Nọmba nnomi nke ihe nlele a ga-anwale (mbibi / ul) = ntinye nke nlele a ga-anwale / ịdị arọ molekụla nke nlele × 6 × 1014

Usoro mgbako nke nọmba nnomi

Ihe dị n'elu bụ usoro mgbako maka ịchọpụta ọnụọgụgụ.Nke a bụ nsogbu mgbakọ na mwepụ nke enwere ike idozi ma ọ gụsịrị akwụkwọ na obere ụlọ akwụkwọ sekọndrị, na kọmputa na-edozi nsogbu mgbakọ na mwepụ.Ọ bụrụ na ị ghọtaghị, ị nwere ike ịbịa kparịta ụka.
ikwu quantification
A na-ejikarị ọnụọgụ ọnụọgụgụ eme ihe na nyocha sayensị.Nje ole nje dị na 1ml nke ọbara, ma ọ bụ nje DNA, nke a bụ ihe omume na-ekpebi ihe dị iche iche: ọnụ ọgụgụ ọbara nwere ike ikpebi, na nje DNA dị ntakịrị.Otú ọ dị, ọ na-esiri anyị ike iji ọnụ ọgụgụ nke nsụgharị nke mkpụrụ ndụ ihe nketa dị na akwukwo, n'ihi na ọ na-esiri ike ikpebi nha, ịdị arọ, na ịdị nro nke akwụkwọ ahụ, ọnụ ọgụgụ nke RNA amịpụtara siri ike ịchọpụta, na arụmọrụ nke ntụgharị ntụgharị na-esikwa ike ịchọpụta , ya bụ, nzọụkwụ ọ bụla nwere ike ime ka data nnwale ahụ nwee nsogbu na enweghị ike iji ya mee ihe.
Ya mere, ntule nke ikwu ga-ewebata otu mmewere:mkpụrụ ndụ ihe nketa nke ime .
N'ikwu ya n'ụzọ ọzọ, ọnụọgụ nke ikwu bụ n'ezie ntụnyere n'etiti mkpụrụ ndụ ihe e lekwasịrị anya na mkpụrụ ndụ ihe n'ime.Tụnyere n'otu anụ ahụ na otu cell ahụ, mmetụta nke nha nlele, ọnụọgụ mmịpụta RNA, nrụpụta ntụgharị ntụgharị, yana arụmọrụ PCR pere mpe.N'ihi obere ihe nlele ahụ, ma mkpụrụ ndụ ihe nketa dị n'ime na mkpụrụ ndụ ihe ezubere iche belatara.Nke a bụ ya mere anyị ji na-ekwusi ike na ịdị n'otu na nkwụsi ike na mbụ.
Mkpụrụ ndụ ihe nketa nke ime bụ n'ozuzumkpụrụ ndụ ihe nketa ụlọ( mkpụrụ ndụ ihe nketa na-edobe ụlọ ), bụ́ ndị na-ezo aka n’ụdị mkpụrụ ndụ ihe nketa bụ́ ndị a na-egosipụta n’ụzọ kwụsiri ike n’ime mkpụrụ ndụ nile, na ihe ndị ha na-emepụta dị mkpa iji nọgide na-arụ ọrụ ndụ bụ́ isi nke mkpụrụ ndụ.
Agbagharala echiche a.Mkpụrụ ndụ ihe nketa nke ụlọ bụ okwu ọrụ ndu, ebe mkpụrụ ndụ ihe nrịbama nke ime bụ okwu teknụzụ nnwale.Mkpụrụ ndụ ihe nketa ụlọ kwesịrị ịgafe nkwado tupu enwee ike họrọ ha dị ka mkpụrụ ndụ ihe nrịbama nke ime.
Dịka ọmụmaatụ, anyị họrọla ọtụtụ mkpụrụ ndụ ihe nketa ụlọ dị na foto dị n'okpuru iji nwalee ọkwa okwu ha na mkpụrụ ndụ anụ ahụ dị iche iche, wee chọpụta na ọkwa okwu nke β-2-microglobulin dị nnọọ iche na nke mkpụrụ ndụ ihe nketa atọ ndị ọzọ, n'ihi ya, a pụghị iji ha mee ihe dị ka mkpụrụ ndụ ihe nketa n'ime.

Mgbe aghọtachara ọrụ mgbazi nke mkpụrụ ndụ nrụtụ aka n'ime, a na-ewepụta algọridim abụọ n'ihi iwebata mkpụrụ ndụ ihe nrụtụ aka n'ime.
· usoro mgbanaka ọkọlọtọ abụọ
· 2 - △△ Ct usoro (usoro ntụnyere CT uru)
Ọ bụrụ na ị nwere mmasị n'ịmụ ụdị na ọrụ mkpụrụ ndụ ihe nketa, biko hapụ nyocha na algọridim wee jiri usoro ozugbo, ma ọ bụ jiri igwe ozugbo;ọ bụrụ na ị bụ nwoke kwụ ọtọ na mgbakọ na mwepụ na injinia, biko nweere onwe gị.
usoro mgbanaka ọkọlọtọ okpukpu abụọ
Gbanwee mkpụrụ ndụ ihe nketa na mkpụrụ ndụ nchekwa ụlọ nke nlele njikwa na ihe nlele a ga-anwale site na usoro ọkọlọtọ, wee gbakọọ uru dị ka usoro mgbako si dị, nke bụ ọkwa ngosipụta.
Uru: nyocha dị mfe, njikarịcha nnwale dịtụ mfe
Mwepu: Maka mkpụrụ ndụ ihe nketa ọ bụla, nnwale nke ọ bụla ga-emerịrị usoro usoro
Ngwa: Otu n'ime ụzọ ọnụọgụ abụọ a na-ejikarị na nke a ma ama na ọmụmụ nke usoro okwu mkpụrụ ndụ ihe nketa
Usoro a bụ nke a:

Ọmụmaatụ bụ ndị a:

Gbakọọ ego ole dabere na nsonaazụ ọnụọgụ
2 - △△ Ct usoro (usoro ntụnyere CT uru)

Uru: Ọ dịghị mkpa na-eme ka ọkọlọtọ curve
Ọdịmma: A na-eche na arụmọrụ nkwalite dị nso 100%;ọkọlọtọ ọkọlọtọ bụ <5%, na usoro ọkọlọtọ na arụmọrụ n'etiti nkwalite ọ bụla na-eche na ọ na-agbanwe agbanwe;njikarịcha ọnọdụ nnwale dị mgbagwoju anya karị.
Ngwa: Otu n'ime ụzọ ọnụọgụ abụọ a na-ejikarị na nke a ma ama na ọmụmụ nke usoro okwu mkpụrụ ndụ ihe nketa

N'ezie, nkwuputa arụmọrụ anaghị ekwe omume ịbụ nke zuru oke 1. Usoro mgbazi: Ọ bụrụ na anyị maara na mkpụrụ ndụ ihe nketa na mkpụrụ ndụ ihe nrịbama nwere otu arụmọrụ nkwalite ahụ, mana arụmọrụ nkwalite adịghị nhata 1, mgbe ahụ, 2－△△ Ct nwere ike mezie dị ka: (1+E) ： (1 + E )－, mgbe ahụ, efficiency, efficiency, efficiency. Enwere ike idozi usoro mgbako ka ọ bụrụ 1.95 △△ Ct
Ka ọ dị ugbu a, ọdịnaya gbasara fluorescent quantitative PCR abịala na njedebe.